葛斌1路健2杨智敏3张先平4（遵义医学院附属医院563003）
【摘要】目的：分析不同批号的胚胎培养耗材对胚胎发育潜能的影响，以评估不同批号耗材的稳定性。方法：收集本中心2013年11月-2014年10月年龄＜40岁、常规长方案促排卵新鲜周期382例，根据耗材批号不同随机分为5组，分析各患者胚胎的受精、发育和着床等结局。结果：5组患者平均获卵数、年龄、受精率、卵裂率、优胚率、平均移植数、子宫内膜厚度和着床率比较均无显著差异（P＞0.05）。结论：本中心IVF实验室培养系统和不同批号耗材的IVF结局稳定。
【关键词】IVF实验室；培养系统；耗材【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165（2015）04-0007-02IVFlaboratorycultureofembryonicdevelopmentpotentialevaluationsystemstabilityGEBin1,LUJian2,YANGZhi-min3,ZHANGXian-ping4（Zunyimedicalcollegeaffiliatedhospital,reproductivecenter,Guizhou,Zunyi,563003）abstract:ObjectiveAnalysisofdifferentbatchnumberofembryoculturematerialinfluenceonembryonicdevelopmentpotential,toevaluatethestabilityofdifferentbatchnumberconsumables.Methods:CollectthecenterinNovember2013-October2014age<40,conventionallongstimulateovulationcycle,freshrandomlypidedinto5groupsaccordingtodifferentmaterialbatchnumber,analysissuchasfertilization,developmentandimplantationoftheembryoinpatientswiththeending.Results:5patientsonaverageforeggnumber,age,fertilizationrate,cleavagerate,embryorate,averagenumberoftransplantendometrialthicknessandimplantationratehadnosignificantdifference（P＞0.05）.Conclusion:ThecenterofIVFlaboratoryculturesystem,anddifferentbatchesconsumesthematerialstableIVFoutcome.Keywords:IVFlaboratory;culturesystem;consumable
体外受精—胚胎培养实验室（IVF实验室）培养系统包括温度、湿度、CO2浓度、以及培养胚胎的各种试剂、耗材，其稳定性直接关系到辅助生殖的结局，因此对IVF实验室的培养系统定期进行定期检测是辅助生殖技术中的重要组成部分[1]。目前检测培养系统的方法有小鼠胚胎实验、人精子存活实验和内毒素实验等[2]。本研究通过分析不同批号耗材的胚胎发育情况评估耗材的稳定性，并进一步反应IVF实验室培养系统的稳定性。
1资料与方法1.1资料(1)耗材选择：选择和体外受精—胚胎培养（IVF-ET）操作过程经常用到的耗材，包括：精子离心锥形管、圆底试管、卵子洗涤皿、巴斯德吸管和胚胎培养皿；(2)患者选择：随机收集本中心2013年11月—2014年10月年龄＜40岁、常规长方案促排卵382例新鲜周期，根据耗材批号不同随机分为5组。比较不同批号耗材对胚胎发育潜能的影响。
1.2方法1.2.1超排卵采用常规长方案进行超排卵，黄体中期进行垂体调节，每日注射达菲林至14天左右，停止注射并每日给予促卵泡发育药物肌肉注射及进行B超监测卵泡发育情况，并检查激素情况和子宫内膜厚度，当最大卵泡直径≥18mm，其余有三个卵泡直径≥16mm，且子宫内膜厚度注≥8mm时，当日停用促卵泡发育药物，注射HCG（人绒毛膜促性腺激素）10000Iu，36h后在阴道B超下穿刺取卵。
1.2.2精液处理(1)非连续梯度离+上游法（适用于质量正常精子）：先后加入80%PureCeption梯度培养基和40%PureCeption梯度培养基各1.5ml左右于15ml锥形管中，使两种液体之间有明显分界线，取1～2ml液化的精液加在梯度培养基上面，400×g离心20min；弃上清,将沉淀混匀并重悬于3.5ml精子洗涤培养基（ART-1006)中，500×g离心5min；弃上清，将沉淀混匀并重悬于0.5ml受精培养基（ART-1020）中置于37℃、5%CO2培养箱中待用。
(2)直接洗涤法（适用于严重少、弱精子或经睾丸、附睾穿刺精子）：将精液与3.5ml精子洗涤培养基（ART-1006)充分混匀，500×g离心10min；弃上清，留取0.1ml左右沉淀，反复吹打，置于37℃恒温桶中待用。
1.2.3胚胎观察与评分根据制定方案采用常规体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI)方法受精。常规IVF:吸取上游后的精子，与获能液混合，调节浓度至精卵比例为30000:1左右，将精液用移液管缓慢加入卵子培养皿中受精，受精3h后脱去卵子颗粒细胞，显微镜下观察卵子成熟度和第二极体排出情况；ICSI:将卵细胞置于透明质酸酶中，使用巴斯德吸管反复吹打卵子直至脱去大部分颗粒细胞，卵子在透明质酸酶中时间不宜过长，一般不超过1min，以免透明质酸酶损伤卵子结构，随后将脱去颗粒细胞的成熟期卵子行ICSI操作。受精后18h观察卵子受精情况，25h、42h和66h观察胚胎发育情况并评分，受精后68h左右进行胚胎移植，如有剩余胚胎，则进行冻融保存。评级标准见表1表1体外受精后66～68h胚胎评级标准（卵裂球数目≥6）
注：Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎，Ⅲ、Ⅳ级胚胎为劣质胚胎1.2.4随访移植后14天行血清人体绒毛膜促性腺激素(HCG)检查是否妊娠，移植后40天行阴道B超检查胚胎着床情况1.2.5观察指标受精率：受精卵子个数/成熟卵子总数×100%；卵裂率：卵裂胚胎个数/受精卵子个数×100%；优胚率：优质胚胎个数/正常受精胚胎个数×100%；种植率：宫内着床胚胎数/移植胚胎数×100%。
1.2.5统计学分析数据均采用SPSS11.0统计学软件进行处理，均数间比较用t检验，率之间用X2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果2.1各组间临床资料对比5组不同批号耗材其种植率、平均年龄、平均获卵数、子宫内膜厚度和平局移植数均无统计学差异（P＞0.05）（表2）表2两组间临床资料对比
3讨论IVF-ET是近年来发展的一种新兴技术，目前我国IVF实验室的平均成功率约为40%左右，随着不孕不育患者日渐增加，此成功率已经远远不能满足患者的需要[3]。因此，寻找各种影响成功率的因素并设法提高成功率成为各生殖中心迫在眉睫的首要任务。在IVF-ET过程中，配子和胚胎对环境的变化非常敏感，作为胚胎培养的唯一场所。
IVF实验室的温度、湿度和CO2含量、试剂和耗材的质量有可能成为影响胚胎发育甚至成功率的重要因素[4]。因此，选择正确的质控方法来监测胚胎培养系统的稳定性，是IVF-ET操作技术中不可缺少的一部分。
目前检测培养系统的方法有小鼠胚胎实验、人精子存活实验和内毒素实验等。小鼠胚胎试验是检测实验室耗材、试剂早期应用的方法，但是此实验容易受到非实验室因素的影响，如不同种系的小鼠、小鼠对新环境的应激反甚至喂养季节的不同应等因素都会影响到实验结果[5-6]。精子存活实验具有操作简单、材料易得等优点，但其敏感性及对人体胚胎的直接相关性目前仍有争论[7]。内毒素实验需要需要生物酶活性测定，此方法超出了常规IVF实验室的操作范围，目前已很少用于IVF实验室的质量控制检测[8]。
以上方法检测的均是胚胎或者精子短时内的发育和存活情况，而IVF实验室质量控制要求是在该体系下卵子受精和胚胎发育全过程的潜能，因此，利用回顾性分析胚胎的发育情况和构建胚胎发育质量控制图更能直观有效的检测IVF实验室的质量控制是否真正达到要求[9]。本研究在精子存活实验基础上利用胚胎发育潜能对不同批号的耗材稳定性进行回顾性分析，研究结果发现各组患者平均获卵数、年龄、受精率、卵裂率、优胚率、平均移植数子宫内膜厚度和着床率比较均无显著差异（P＞0.05）。各组受精率最低为76.85%，最低卵裂率为95.72%，最低优胚率为48.76%，各项指标均符合我国人类IVF实验室质量控制标准[5]IVF实验室的整体稳定性是胚胎正常发育的基础，实验室微小环境的改变都会对胚胎的生理学、遗传学产生影响，而这些影响是无法从胚胎形态学中发现的[11-12]。因此，建立一个完善的质量管理系统是IVF实验室的基础。
综上，本研究结果表明本中心所使用的不同批号耗材是稳定的，在质控控制管理系统的指导下，定期进行回顾性分析，用胚胎发育情况进一步验证各种指标的稳定性是有必要的。
参考文献[1]杜涌，张云山，等.质量管理系统在体外受精实验室中的应用[J].国际生殖健康，2013,32（6）:498-501[2]HigdonHL,BlackhurstDW,BooneWR.Incubatormanagementinanassistedreproductivetechnologylaboratory[J].FertilSteril,2008,89(3):70.-710.[3]FrydmanN,FanchinR,LeDuA,etal.ImprovementofIVFresultsandoptimisationofqualitycontrolbyusingintermittentactivity[J].ReprodBiomedOnline,2004,9(5):521-528.[4]黄国宁，刘东云，韩伟.辅助生殖技术实验室的建设及其质量控制[J].中国实用妇科与产科杂志，2010，26（10）：755-757.[5]侯文文，等.新建IVF实验室使用前的生物学检测[J].安徽医学，2014,34（8）:1063-1065.[6]苏亮，罗平，罗江霞.不同来源小鼠胚胎培养在辅助生殖实验室质量控制中的应用[J].华夏医学，2012,25，(1):16-18.[7]纪冬梅，周平，曹云霞，等.利用IVF结局评估胚胎培养系统的稳定性[J].国际生殖健康，2014,33（2）：99-102[8]刘冬云，韩伟，等.如何进行IVF实验室的质控[J].广东医学，2010,31（19）:2481-2483.[9]武文斌，杨悦，杨恒，等.卵裂率质量控制图在体外受精实验室的建立[J].中国妇幼保健，2014,24（29）:3949-3950.[10]黄国宁，孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].北京：人民卫生出版社，2012:35-36.[11]MachtingerR，RacowskyC.Morphologicalsystemsofhumanembryoassessmentandclinicalevidence[J].ReprodBiomedOnline，2013，26（3）：210-221.[12]StromS,Rodriguez-WallbergK,HolmF,ertal.Norelaotionshipbetweenembryomorphologyandsuccessfuiderivationofhumanembryonicstemcelllines[J].PlosOne,2010,5(12):153..作者简介：葛斌（1981－），男，安徽涡阳县人，助理研究员，医学硕士，研究方向：生殖遗传学，邮箱：38248866@qq.com
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