简介：新生血管是指从已有毛细血管发展形成新血管，该过程受血管生成因子和血管抑制因子双重调控，是一个动态平衡的过程。新生血管是多种疾病的病理性改变，包括肿瘤、早产儿视网膜病变和糖尿病视网膜病变等，是严重的致残性病变。建立新生血管动物模型是研究这些疾病发病机制的重要前提，本文主要对主动脉环血管生成模型、基质胶栓动物模型、氧诱导视网膜病变模型、激光诱导脉络膜新生血管动物模型4种建模方法进行了综述。

简介：目的:利用Adeasy-1系统,构建并鉴定CARP基因重组腺病毒载体.方法:PCR扩增含有CARP全长cDNA的片段,经测序验证无误后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒.经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒,再在293细胞中进行包装扩增,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:测序证实PCR产物为CARP全长cDNA;抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;转染293细胞3天后可见绿色荧光,回收病毒可以重复感染293细胞,证明病毒包装成功.

简介：目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒（靶位点分别为＋370-388位,＋376-394位,＋545-563位,＋1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向（＋370-388位）位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。

简介：目的构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白（rhINGAP）载体毕赤酵母。方法通过PCR扩增INGAP基因，插入到重组质粒α,／pUC18的α因子信号序列处，再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K，SalI酶切线性化重组质粒αINGAP／pPIC9K。电穿孔转化毕赤酵母，营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子，PCR鉴定是否含有目的基因INGAP，甲醇诱导rhINGAP的表达，Westernblotting鉴定目的蛋白，ELISA法定量测定其含量。结果重组表达质粒αINGAP／pPIC9K经酶切获得758bp片段，符合α因子与INGAP片段融合的长度，筛选得到3个阳性转化子，培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白。结论成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株。

简介：2007年3月24日，阳光明媚，春风拂煦，在鲜花和绿树簇拥的山东大学食堂广场上，山东省卫生厅、山东省教育厅、山东省结核病防治中心、山东大学、山东省胸科医院、山东防痨协会、济南市卫生局和济南市结核病防治所联合举办了“构建无结核病的和谐校园系列启动仪式暨3．24世界防治结核病日大型宣传咨询活动”。

简介：目的构建含Sonichedgehog（SHH）蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体。方法通过BamH1、Xho1双酶切、T4连接酶连接，将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体，构建pET22b-SHH-N质粒；经PCR扩增，产物再与pTA2载体连接，构建pTA2-SHH-N重组质粒；经EcoR1及Not1双酶切、T4连接酶连接，将SHH—N端基因片段插入pPIC9K质粒，构建pPIC9K-SHH-N重组质粒；通过线性化、脱磷酸化，将线性化pPIC9K-SHH-NDNA转染毕赤酵母菌株GS115，最后经PCR扩增和测序鉴定。结果转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段，与原始的基因片段序列完全一致。结论成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体。

简介：目的构建人神经元正五聚蛋白2（NPTX2）真核表达载体，转染人胰腺癌细胞PANC1，建立稳定转染的细胞系。方法通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA，利用NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋），经酶切和测序验证后，用脂质体转染法转染PANC1细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的PANC1细胞，用实时定量PCR方法筛选NPTX2mRNA高表达克隆。结果成功构建了pcDNA3．1（＋）-NPTX2真核表达载体，并建立了稳定转染的PANC1细胞，成功表达了目的基因。结论真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础。

简介：目的构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体（aproliferation—inducingligand，APRIL）基因的shRNA慢病毒表达载体。方法应用基因工程技术，筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列，与pGCL—GFP载体连接，构建慢病毒表达载体LV—shAPRIL；将连接产物转化到DH5a感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。再用LV—shAPRIL、pHelper1．0、pHdper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒。重组慢病毒感染CFPAC1细胞，实时定量PCR和Westernblotting检测CFPAC1细胞APRILmRNA和蛋白的表达。结果PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致，经包装产生的病毒滴度为5×10^7Tu／ml。构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周，APRILmRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73％、70％和71％；APRIL蛋白表达量分别下降了66％、63％和62％（P〈0．05）。而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异（P〉0．05）。结论成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV—shAPRIL。

简介：RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指生物体内由双链RNA介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默的现象。

简介：目的：构建含解耦联蛋白2（UCP2）-3’非翻译区（UTR）序列的野生型和突变型质粒的双荧光素酶报告基因载体．探讨微小RNA（miR）-15b对UCP2基因表达的调控作用。方法：应用生物信息软件预测miR-15b的靶基因，分别将预测靶基因UCP2的3’UTR及其突变体克隆到荧光素酶载体DsiCHECK-2骨架中，构建UCP2野生型和突变型质粒。并采用测序方法鉴定DsiCHECK-2-UCP2载体是否构建成功。将UCP2野生型和突变型质粒分别与miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照在293T细胞中共转染。通过双荧光素酶报告基因检测分析miR-15b对UCP2基因表达的调控作用。结果：测序鉴定证实psiCHECK-2-UCP2双荧光素酶报告基因载体构建成功。双荧光素酶报告基因检测显示转染UCP2野生型和UCP2突变型报告基因的293T细胞过表达miR-15b后，UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显下降．下调31％（P=0．003），过表达miR-15b抑制剂后，UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显增加，上调46％（P=0．01）。而miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照对UCP2突变型的表达均无明显影响（P〉0．05）。结论：UCP2是miR-15b直接作用的靶基因，且miR-15b结合于UCP2基因3’UTR区域．转录后水平对UCP2有直接的抑制作用。

简介：目的目前的硫化氢（H2S）研究仍缺乏理想的供体。本研究旨在利用介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）合成一种新型的控释H2S供体，并评价其在体外实验中释放H2s的特点。方法溶胶。凝胶法制备均一大小的MSN。将二烯丙基三硫化物（DATS）负载至MSN孔道中，合成控释H2S系统（DATS-MSN）。分析其表征、释放H2S的特点、细胞毒性聃细胞摄取能力。结果DATS-MSN可在体外缓慢、持续、可调节的释放H2s。其可被心肌细胞成功摄取，在常规应用的浓度范围内未见明显细胞毒性。结论DATS-MSN可在体外环境中缓慢而可控的释放H2S，并具备良好的体外安全性，是H2S体外研究的良好工具。

简介：目的构建鼠野生型肿瘤坏死因子（Wildtypetumornecrosisfactor—alpha，wtTNF—α）和跨膜型肿瘤坏死因子（Transmembranetumornecrosisfactor—alpha，tmTNF—α）基因真核表达载体，转染心肌细胞，比较两型TNF—α对心肌细胞凋亡的影响。方法应用RT—PCR方法从小鼠腹腔臣噬细胞中扩增wtTNF—α基因编码区，根据小鼠TNF氨基酸序列设计缺失肿瘤坏死因子转化酶（TNFalphaconvertingenzyme，TACE）作用位点（缺失1-12位氨基酸）的突变引物，通过重叠PCR得到构建不被TACE剪切的TNF-α突变体，即跨膜型肿瘤坏死因子tmTNF—α，扩增得到的wtTNF-α，tmTNF—αPCR产物经EcoRI＋BanHI双酶切后克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中并转染入大鼠H9c2（2—1）心肌细胞，用RT—PCR及WesternBlot方法鉴定转染效率及不同表达载体对心肌细胞凋亡的影响。结果成功构建pIRES2-eGFP—wtTNF和pIRES2-eGFP-tmTNF真核表达载体并转染大鼠H9c2（2—1）心肌细胞，tmTNF—α对心肌细胞无明显促凋亡作用，而wtTNF—α可以诱导心肌细胞凋亡。结论由于wtTNF—α可被酶解产生sTNF-α，提示sTNF—α，而并非跨膜型TNF-α对该心肌细胞株具有诱导凋亡的作用。