简介:目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是最合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞最大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一套比较行之有效的方法.材料与方法:采用中国实验用小型猪,常规麻醉、消毒、开腹,用D-Hank′s液进行肝脏原位灌注,再用0.02%EDTA-Hank′s液(37℃)灌注18~20min,摘取肝脏行多点灌注5min,置肝脏于60目钢网上,用直剪迅速剪开肝脏被膜,用镊子夹起轻轻抖动,并用1640液冲洗,边抖动边冲洗,使细胞滤出漏于烧杯中.与此同时,用剪刀把肝组织剪成小块,再用玻璃注射器芯轻轻研磨,边研磨边冲洗,操作要轻,并保持无菌,收集肝细胞,离心洗涤三次,并逐级用80目、100目、120目、150目钢网过滤.分离出的肝细胞进行计数、台盼蓝拒染试验检查、PAS染色、葡萄糖-6-磷酸酶染色及电镜检查.结果:肝细胞存活率90±1.3%,PAS染色显示肝糖元丰富,葡萄糖-6-磷酸酶染色显示酶的活性良好.电镜观察,肝细胞的线粒体、内质网等亚显微结构未见异常.对于猪肝细胞的分离,国外文献报道多采用Ⅳ型胶原酶循环灌注法,但费用很昂贵.在实践中,我们用EDTA代替胶原酶,采用肝脏原位灌注+多点灌注+机械研磨的方法,取得了较为满意的效果.此法与胶原酶灌注法比较,从分离的肝细胞数量、活力、肝糖元及细胞中一些酶的活性都与胶原酶法无显著差异,且光镜及电镜观察,显示细胞形态及亚细胞结构未见异常.我们认为此方法易于控制,价格低廉;而胶原酶法容易消化过度,造成细胞膜破损,或消化不完全造成多个细胞连在一起,且费用昂贵.实验证明,改良的猪肝细胞分离方法为用猪肝细胞治疗急性肝衰病人的研究提供了一个可行的方法.
简介:树突状细胞(DC)是一类专职性抗原呈递细胞,不仅启动免疫反应和诱导免疫耐受,还在调节免疫反应与免疫耐受的平衡中起决定性作用.肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中深受关注,肝移植物容易存活,伴有肝移植的其他器官(如心脏、肾脏等)移植存活时间也较其单独移植明显延长.最近有人提出,在肝移植耐受中DC可能起关键作用,但因其难于分离培养,国外仅美国Pittshburgh大学在做相关研究,国内尚未见报道.材料与方法:1.肝非实质细胞的分离:取6~8w小鼠,麻醉后无菌开腹,门静脉插管,用前灌液(PBS+肝素500μ/100ml)灌流2~3min,改用注射器缓慢推注2mlⅣ胶原酶(GIBCOL公司,0.05%);取材后剪碎,15mlⅣ胶原酶液(0.05%)体外消化30min.尼龙网过滤,PBS液清洗(400g×5min离心)两次,稀释成4~5ml细胞悬液.下铺细胞分离液Percoll(Pharmacia公司)制成的不连续密度梯度液,500g×30min离心后,细胞分三层,先吸弃最上层细胞碎片,再吸取两液体界面的肝非实质细胞,避免吸到最底层的血细胞,RPMI1640液(GIBCOL公司)清洗两次,400g×5min离心,即可得肝非实质细胞.2.肝树突状细胞(HDC)的培养:将肝非实质细胞用含灭活的10%胎牛血清(GIBCOL公司)的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2.5×106/ml,接种于24孔培养板,每孔1ml,加GM-CSF(GIBCOL公司)10ng/ml.培养第三天轻轻吸去未贴壁细胞,换液.后隔天半量换液,培养第7~8d可收取HDC.结果与讨论每只小鼠可得肝非实质细胞约1.0~1.5×107个,细胞大小不一,类型较多.培养24~48hr后,有大量细胞贴壁生长,少量HDC前体细胞半贴壁状散在分布,经筛选、扩增,第4d时HDC数量增多,出现6~8个细胞组成的小集落.第7~8d,HDC数量增多,此阶段细胞有一明显的增殖高峰,有大量半贴壁半悬浮的集落,集落表面的细胞有小的突起.第7~8d,每只小鼠HDC得率约为2~3×106个.因HDC难于分离培�
简介:四种变异畸形的个例报导付乙,袁琼加成都体育学院一、梨状肌缺如:中年男尸。局解中发现右侧梨状肌缺如,仅有臀中肌在梨状肌的位置。坐骨N穿臀中肌后部中份纤维出骨盆。臀上A.V.N点距骶后正中线6.9cm,距髂嵴上缘垂直线5.8cm。坐骨结节内侧缘距大转子外...
简介:目的探讨Mainz急诊评分系统在急诊护理中的应用。方法按照Mainz急诊评分要求设计调查表格,由急诊科首次接诊护士和各接诊医生在患者就诊时对各项参数进行测量记录,并根据评分分为四个分数段:1-5分,6-15分,16-25分,25-28分。根据评分制定相应级别的护理计划,并追踪各分数段患者的去向和预后,加以比较。结果25-28分17例,瞩其回家观察;16-25分109例,在急诊留观治疗2-24h后离院,给予一般护理;6-15分154例,予以一级护理,38例入ICU,116例收住专科病房(HDU);1-5分患者72例,予以特级护理,收入我院ICU。结论Mainz急诊评分能较好的预判急诊患者的病情危重和病死危险性,根据评分对患者施行相应的分流转诊和制定护理方案可提高急诊科护士的工作效率,减少工作量。
简介:组织学特殊染色技术及免疫组织化学技术已广泛应用于基础医学和临床医学的科研工作中.本快速染色法即用组织学醛品红染色法和免疫组织化学SP法在同一张切片上对胰岛B细胞和A细胞进行了双重染色,取得较好的效果,现作简单介绍.取大鼠胰腺,Bouin液固定,石蜡包埋,切5μm厚切片.双染步骤如下:第一步,胰岛B细胞的醛品红染色:切片脱蜡到水;入0.25%浓硫酸和0.25%高锰酸钾等量混和液中3min;蒸馏水洗后入5%草酸2min;蒸馏水洗;再经70%酒精后入醛品红染液15min;70%酒精分色后,蒸馏水洗.第二步,胰岛A细胞的免疫组化染色:将经醛品红染色后的切片,入3%甲醇双氧水室温孵育15min;蒸馏水洗后枸橼酸缓冲液(0.01M,pH6.0)(电炉加热煮沸92℃~98℃)进行抗原修复10min;PBS浸泡5min后,用正常羊血清室温封闭30min;弃去多余羊血清,滴加一抗(抗胰高血糖素抗体,1∶1500),37℃,孵育2hr;PBS室温洗10min后,滴加生物素标记的二抗,37℃,孵育40min;PBS室温洗10min后,滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃,孵育40min;PBS室温洗10min,DAB显色.结果及讨论:此染色方法在同一张切片上所观察到的胰岛B细胞呈蓝紫色,而胰岛A细胞呈棕黄色,两者颜色对比清晰.细胞核不着色.本方法可在一个工作日内完成,即提高了工作效率,又减少了免疫组织化学多重染色中步骤多、时间长,易受外界因素影响的限制,进而降低了非特异性染色.因此,该方法在科研工作中具有一定的应用价值.
简介:微循环是脉管系的一个组成部分,主指微小血管(口径为2~250μm内)的血液循环,血液通过微循环直接向组织细胞提供氧和其它营养物质,并带走二氧化碳和废物.微循环的调节机理与脉管系的其它部分有所不同.微循环可根据组织需要调整局部血流.在教学和科研中,如何做好微循环的标本是很重要的.在肠系膜标本中,我采用了大白鼠、小白鼠、豚鼠、大白兔四种动物的肠系膜作了比较,最后认为采用大白鼠的肠系膜较为理想,操作简单,结构典型,对比清晰,能满足教学和科研的需要.动物选择:大白鼠200g左右,水合氯醛麻醉后打开腹腔,用线接扎胃幽门和直肠将整个消化道取下来,放在24cm的蜡盘中,用大头针将肠道的系膜顺其自然而展开,倒于AF固定液(95%酒精80ml;福尔马林20ml)固定45min,用蒸馏水洗2~3次.用Hansen苏木素染色10min,充分水洗约5min,用0.5%盐酸酒精分色1min,充分水洗15min,入70%酒精5min,入0.5%伊红染5~10min.入80%、95%、100%酒精脱水10~15min.入二甲苯透明10min.用眼科剪将肠系膜剪成2mm的正方形平铺在载玻片上镜检,中性树胶封片.结果:微循环的血管呈树枝样蓝色交错成网,内含丰富桔红色的血细胞.在血管的终末处,可见变形为长条形的血细胞和清晰可见的末端小动静脉间的通路以及毛细血管前括约肌.注意事项:结扎肠道必须防止肠道内容物溢出污染固定液和染液.固定液、染液量要适中,以埋没标本为好.取材一定要新鲜,10min内完成.