简介:目的:建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法:提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒,以梯度稀释质粒为标准模板,选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物,进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果:标准曲线为y=-4.284x+53.468,由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系(R2=0.999609),检出敏感度可达1×10^2拷贝/μL,且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24h后的病毒拷贝数,其病毒拷贝数随时间增加,与细胞病变(CPE)变化保持一致,且荧光定量PCR的测量结果稳定(变异系数〈6%)。结论:建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT—PCR方法,该方法灵敏度高、特异性强。
简介:目的:检测抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)转基因山羊外源基因的拷贝数及ATⅢ蛋白的表达量,分析拷贝数与蛋白表达量的相关性。方法:用Primer5.0软件设计外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物,以倍比稀释的标准品进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,通过标准曲线计算外源基因拷贝数;通过酶显色底物法检测ATⅢ蛋白的含量。结果:依据ATⅢ和GAPDH基因标准曲线方程计算得到的山羊个体间外源基因的拷贝数相差很大,最少的为5,最多为25,且不同转基因山羊间ATⅢ表达水平的差别达10倍以上。结论:外源基因表达水平在受到拷贝数的影响外,也受到整合位点等其他因素的重要影响。
简介:在维持机体内环境稳态中,循环血液起着关键作用。血液成份的变化在疾病诊断与疗效判断中十分重要。因此,采用血清、血浆或全血,是一个涉及临床医疗与科研质量的重要问题。WHO于2002年邀请41位专家进行专题研讨,并发表了一个报告,比较详尽地评述了血清、不同抗凝剂制备的血浆和全血在常用临床检验中的应用,并介绍了各种血标本相关指标的稳定条件。近20年来,许多学者在这一领域已进行了大量工作。虽然我国也有人开始注意这一问题,但还不够重视。例如,血糖测定,WHO推荐使用EDTA抗凝全血,肝素抗凝全血需谨慎应用;但明确指出不宜使用血清,否则测定值偏低。北美与欧洲很少采用血清测定血糖。但我国不少检验医学书籍仍然推荐使用血清,甚至在高等医学院校教材中推荐使用血清(浆)标本,将两者视同相等。产生这些不妥的原因,主要与生理学和生物化学教学中长期强调血清是缺乏纤维蛋白原的血浆所致。因此,明确血清与血浆的重要差别是非常必要的。