注射用氨曲南细菌内毒素检查方法干扰试验研究

注射用氨曲南细菌内毒素检查方法干扰试验研究

1陈艳    2 吴清刚

1海南全星制药有限公司  海南省海口市  570216

2海南合瑞制药股份有限公司  海南省海口市  570311

【摘要】目的：建立注射用氨曲南细菌内毒素检查方法。方法：采用凝胶限度法。取规格为0.5g的供试品1支，用细菌内毒素检查用水2.5ml溶解成浓度为每ml含氨曲南200mg的供试品溶液，再用细菌内毒素检查用水稀释为每ml含氨曲南2.5mg的供试品溶液，用两个厂家灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，结果：Es和 Et均在0.5λ～2λ之间。结论：供试品浓度为2.5 mg/ml时，供试品对凝胶法无干扰，通过方法确认，结果符合规定。该方法准确、高效，能有效控制其质量。

【关键词】注射用氨曲南；细菌内毒素检查；凝胶限度法；鲎试剂

1. 设备

040516净化工作台，DK-98-Ⅱ型数显恒温水浴锅，XW-80A型旋涡混合器，20-200ul移液枪，100-1000ul移液枪。

2. 物料

所有本次确认实施用到试剂和物料均在有效期内，供货厂家均为合格供应商，供试品为我司GMP环境下生产的合格产品。

表1试剂和物料

3. 确认程序和确认结果总结

3.1制备内毒素标准对照溶液（C）[1]：

取细菌内毒素工作标准品90EU（来源：中国食品药品检定研究院）1支，加细菌内毒素检查用水1.0ml溶解，浓度为90EU/ml；在旋涡混合器上混匀15分钟，然后用细菌内毒素检查用水稀释成10EU/ml，进一步制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟以上，具体操作见下表2。

表2：细菌内毒素工作标准品(CSE系列)稀释

3.2制备供试品溶液(A)：

取规格为0.5g注射用氨曲南1支，加细菌内毒素检查用水2.5ml溶解并混合均匀，制成浓度为200mg/ml的供试品溶液，用细菌内毒素检查用水进行一系列倍数的稀释，具体倍数及操作法，见表3。使用2个鲎试剂厂家的鲎试剂，分别进行正式干扰试验。

表3 供试品溶液稀释倍数

3.3制备含内毒素的供试品溶液（B）：

用3.2项下稀释40倍（5mg/mL）的供试品溶液将3.1项中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ, λ, 0.5λ, 0.25λ的含内毒素的80倍（2.5 mg/mL）的供试品溶液，具体操作法，见表4。

表4：供试品阳性对照溶液(PPC系列)稀释

3.4鲎试剂的溶解：

每个厂家取规格为0.1 mL/支灵敏度为0.25 EU/mL的鲎试剂30支，轻弹壁使粉末落入瓶底，启开，防止玻璃屑落入瓶内，备用。每支加入0.1 mL细菌内毒素检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

3.5加样：

将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在泡沫板上，排成5列，每列2支（管）。其中的4列每列每支分别加入0.1 mL的2λ, λ, 0.5λ, 0.25λ的内毒素标准溶液（C），另一列2支（管）加入0.1 mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照（D）。如图1。

图1

将另外20支（管）鲎试剂放在泡沫板上，排成5列，每 列4支（管）。其中的4列每列每支分别加入0.1 mL的含2 λ, λ, 0.5 λ, 0.25 λ的内毒素标准品的供试品溶液（B），另一列4支（管）加入0.1 mL用于干扰试验稀释倍数（浓度2.5mg/ml）的供试品溶液作为样品阴性对照(A)。见图2。

图2

 

加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同泡沫板放入37℃水浴中，保温60分钟后，观察结果。

4.干扰试验结果汇总

正式干扰实验浓度：2.5mg/ml。

表5  注射用氨曲南干扰试验检查结果表

 注：Es=lg-1﹝∑Xs/2﹞         Et=lg-1﹝∑Xt/4﹞

Es：用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值

Et：用供试品溶液或稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值

Xs：用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的对数值

Xt：用供试品溶液或稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的对数值

5. 讨论

以上结果阴性对照（D）和供试品溶液阴性对照(A)均为阴性，鲎试剂标示灵敏度对照系列（C）的结果（Es）在0.5λ～2λ之间，试验有效[2]。干扰试验系列（B）的结果（Et）在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）之间，注射用氨曲南的细菌内毒素检查，在该浓度（2.5mg/ml）下无干扰作用。成功确认了供试品细菌内毒素检查的准确性和有效性。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2020年版 四部[S].北京：中国医药科技出版社，2020：178-181.

[2] 国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017：614-620.