药用高活性胰酶生产工艺的研究

(整期优先)网络出版时间:2024-07-23
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药用高活性胰酶生产工艺的研究

包前德门

赤峰市云淞科技发展有限责任公司 024000

摘 要

胰酶又称胰液素,是一种常用的医药、工业的原料药,其成本低廉易于获取,且所含活性物质种类丰富,可以作为基础原料从中提取多种生化药品,是多种酶的混合物,如:激肽释放酶、弹性蛋白酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、胰糜混合酶、脂肪酶、淀粉酶等等。随着科学技术发展对胰酶里蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性要求不断提高,尤其对脂肪酶的活性要求比较高,其中胰蛋白酶水解蛋白质生成蛋白胨及其衍生物,胰淀粉酶水解淀粉生成糊精、麦芽寡糖及麦芽糖,胰脂肪酶水解脂肪生成甘油和脂肪酸等。在中性或弱碱性条件下活性最强,为助消化药物,用于消化不良、食欲不振、胰腺疾病所引起的消化障碍及糖尿病人的消化不良等。

实验结果表明,该工艺制备的胰酶里的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性和收率比较高,蛋白酶活性4500u/mg左右,脂肪酶活性40000u/mg左右,淀粉酶活性80000u/mg左右,收率达17%以上。该工艺操作简便、成本低、重复性好、活性高、收率高。

关键词:胰酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶

 


前 言

高活性药用胰酶是从牛或猪的胰脏中提取得到的一种混合酶制剂,主要含有胰蛋白水解酶类、脂肪酶和淀粉酶。胰脏含有十分丰富的水解和消化酶,体内蛋白质的消化主要靠胰酶。胰酶水解蛋白质所得产物仅三分之一为氨基酸,其余与寡肽[1]。胰蛋白酶刚从胰脏分泌时,是以没活性的酶原形式存在,经肠激酶和氯化钙的作用下才能变有活性的酶。胰蛋白酶水解蛋白质变成蛋白胨及衍生物,胰淀粉酶是一种淀粉a-1,4-糊精酶,它水解淀粉的限度为30%~90%,主要作用于淀粉的a-1,4-糖苷键,生成糊精、麦芽寡糖和麦芽糖。胰脂肪酶是水解脂肪分子中甘油酯键生成甘油和脂肪酸[2]。药用胰酶是否具有胰脏中按天然比例的酶特性,生产工艺而定。

化学组成和性质:胰酶是从动物胰脏中提取的一种酶的混合酶,呈白色或淡黄色无定形粉末,有特殊的肉臭味,有吸湿性,部分溶于水及低浓度的乙醇溶液中,不溶于高浓度乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中。水溶液在酸性时(PH2~3)稳定,PH6以上时不稳定,氯化钙可增加其稳定性,遇酸、热、鞣酸及重金属时蛋白质产生沉淀。胰蛋白酶最适PH值为8.0-9.0,胰脂肪酶最适PH值为7.0,胰淀粉酶最适PH值为6.9,用胰酶作水解剂时,PH值控制在7-9为宜。胰酶在体内最适温度为37℃,在体外当水解剂使用时一般采用45-50℃为宜[3]

原辅材料:新鲜冷冻胰脏,十二指肠,氯化钙,新丙酮,

设备及工具:绞肉机,胶体磨,一级分离机,二级分离机,240目布袋,压榨机,离心机,制粒机,烘干机,粉碎机,温度计,比轻计,不锈钢桶,尼龙棒

分析仪器:紫外可见分光光度计,分析天平,烧杯,容量瓶,干燥箱,超声波清洗仪,恒温水浴锅,精密恒温酶测定仪

以猪胰脏为原料用丙酮的提取工艺:

工艺设计: 胰酶生产工艺流程图及环境区域划分

 

 

工艺流程:

冻胰脏  解冻 绞肉肉糜  水、丙酮胰浆激活、自溶    一次分离    加丙酮                                       

胰乳  二次分离    沉淀 吊滤、压榨      粗制胰酶  脱脂、干燥  胰酶成品

工艺过程:

1、解冻:如果胰脏是冻品,需在室温解冻数小时,解冻非常关键,影响活性和收率[4]

2、绞肉、磨浆:绞肉不宜太粗,磨浆温度控制低温。

3、提取、激活:提取胰脏重量的0.5倍水,20%回收丙酮,6%十二指肠,0.2%氯化钙,温度控制10℃-15℃为佳,搅拌两小时,自溶激活20小时左右。整个过程最好是恒温,保证活性和收率稳定。

4、沉淀:加0.83左右的回收冷丙酮。超过0.85的回收丙酮,适当加大丙酮量,使丙酮浓度达到0.900-0.895控制。

5、吊滤:用240目布袋吊滤,丙酮淋差不多了,进行压榨,加快丙酮的渗出。

6、压榨:尽量压干,后期好脱脂、脱水。压榨次数看滤饼的干湿情况而定,泡冷新丙酮里进行脱脂,室温放置一夜,隔天进行二次压榨,在跑一次冷新丙酮了进行脱脂,2-4小时为宜。

7、离心、制粒:脱脂、脱水最后离心,离心机电机防爆的,用14目的摇摆制粒机制粒,上烘干机进行干燥。

8、干燥:温度不宜过高,控制在55℃左右,如果真空干燥的情况下温度可以逐渐升至60℃左右,烘干时间控制好,胰酶活性对温度很敏感。

9、成品:微生物有要求,后期的离心、制粒、烘干需在D级洁净环境下进行。

10、活性:蛋白酶4600u/g,脂肪酶41000u/g,淀粉酶85000u/g。

11、收率:收率能达到17%,最高能达到20%以上。

12、丙酮的回收:丙酮回收塔进行回收,丙酮浓度控制在0.82左右,回收率90%以上。

检测活性:

1蛋白酶

对照品溶液   精密称取酪氨酸0.0501g加0.2mol/L盐酸溶液至100ml容量瓶中,并稀释至刻度。

供试品溶液  取本品各0.1025g,0.1027g,精密称定,置乳钵中,加冷至5℃以下的氯化钙溶液少量,研磨均匀,置100ml量瓶中,加氯化钙溶液至刻度,摇匀;精密量取1ml置50ml量瓶中,加入冷至5℃以下硼酸盐缓冲液至刻度,摇匀。

酪蛋白溶液  称取酪蛋白1.5g,加0.1mol氢氧化钠溶液13ml与加水40ml,在60℃水浴中溶解后,放冷,用水稀释至100ml,调节PH值至8.0 即得。

检验方法

取试管6支,分别精密量取供试品原液1ml与硼酸盐缓冲液2.0ml,在40℃水浴中保温10分钟,分别精密加入在40℃水浴中保温的酪蛋白溶液5ml,摇匀,立即置于40℃±0.5℃水浴中准确反应分钟,再各精密加入5%三氯醋酸溶液5ml终止反应,混匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液;精密量取供试品原液1ml,加硼酸盐缓冲液2.0ml,在40℃±0.5℃水浴中保温10分钟,精密加5%三氯醋酸溶液5 ml,摇匀,置40℃±0.5℃水浴中准确反应30分钟,立即精密加入酪蛋白溶液5ml,摇匀,滤过,取续滤液作空白对照;照分光光度法,在275nm波长处,测定并计算供试品溶液的吸收度的平均值(A)。供试品溶液测得的A值应在0.15~0.6,否则应调整浓度,另行测定。

另用0.2mol/l盐酸溶液作空白对照,在275nm的波长处测定对照品的吸收度(As)。按下式计算[5]

每1g胰蛋白酶活力(单位)=

质量标准:按干燥品计算,每1g中含胰蛋白酶活力不得少于600单位。

2、淀粉酶   

供试品溶液:取本品各0.3014g,0.3009g,精密称定,置乳钵中,加冷至5℃以下的磷酸盐缓冲溶液少量,研磨均匀,置200ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液稀释至刻度,摇匀。

测定方法

取1%可溶性淀粉溶液25ml、磷酸盐缓冲液10ml、1.2%氯化钠溶液1ml与水20ml,置250ml碘瓶中,在40℃水浴中保温10分钟,精密加入供试品溶液1ml,摇匀,立即置40℃±0.5℃水浴中准确反应10分钟,加1mlo/L盐酸溶液2ml终止反应,摇匀,放至室温后,精密加碘滴定液(批号/有效期                 )(0.05mol/L)10ml,边振摇边滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液45ml,在暗处放置20分钟,加硫酸(1→4)4 ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定至无色。另量取1%可溶性淀粉溶液25ml、磷酸盐缓冲液10ml、1.2%氯化钠溶液1ml与水20ml,置碘瓶中,在40℃±0.5℃水浴中保温10分钟,放至室温后,加1mlo/L盐酸溶液2m,摇匀,加入供试品溶液1ml,摇匀,精密加碘滴定液(0.05mol/L)10ml,边振摇边滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液45ml,在暗处放置20分钟,加硫酸(1→4)4 ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)的硫代硫酸钠滴定液应为2.0~4.0ml,否则应调整浓度,另行测定。

每1g含胰淀粉酶活力(单位)=

质量标准:按干燥品计算,每1g中含胰淀粉酶活力不得少于7000单位。

3脂肪酶

取样品精密称定,0.1026g ,0.1030g,置乳钵中,加冷至5℃以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液少量,研磨均匀,置100ml量瓶中,加三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至刻度,摇匀。

测定方法

量取橄榄油乳液25ml、牛胆盐溶液2ml与水10ml,置100ml烧杯中,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)调节pH值至9.0,在37℃±0.1℃水浴中保温10分钟,再调节pH值至9.0。精密量取供试品溶液1ml,在37℃±0.1℃水浴中准确反应10分钟,同时用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定使反应液的pH值恒定在9.0,记录消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的量。另取在水浴中煮沸15~30分钟的上述供试品溶液1ml,照上述方法测定作空白对照。

每1g含有胰脂肪酶活力(单位)=

式中:A为供试品消耗氢氧化钠滴定液的容积,ml。

B为空白消耗氢氧化钠滴定液的容积,ml;

M为氢氧化钠滴下液的浓度,mol/L; 

W为供试品取样量,g;   n为供试品稀释倍数

质量标准:按干燥品计算,每1g中含胰脂肪酶活力不得少于4000单位。

4、微生物限度 取本品,照非无菌产品微生物限度检查:

1g供试品中需氧菌总数不得过10000cfu,霉菌和酵母菌总数不得过100cfu,不得检出大肠埃希菌。10g供试品中不得检出沙门菌。

讨论:综上所述,高活性胰酶的提取生产取决于从原料、辅料的采集开始严格把控,遵守工艺规程和操作规程,符合条件的硬件、软件和高素质的操作人员才能生产出达标的产品,高质量的产品用途更广泛、价值更高。

1、原料处理:采集胰要在4h内送入冷库,于-18℃以下冷冻,若立即投料不用冷冻,冷藏就可以。胰脏先刨片再绞肉,有助于胰酶提取。

2、酶原激活:温度和PH值至关重要,温度控制在10℃-15℃,温度低可适当延长激活时间,温度高适当缩短时间。弱酸性条件下加钙离子和十二指肠,效率高激活充分。

3、提取溶剂的选择:一般采用丙酮提取,也可采用乙醇和异丙醇,用乙醇提取脂肪酶失活比较严重,后期脱水困难。异丙醇提取收率低,回收温度高,能源消耗较高。

4、稳定高活性:控制好生产每个环节,过去认为好产品是检验和生产出来的,而现在引入“质量源于设计”的概念。不仅要有现代厂房和先进设备的硬件基础和文件、管理的软件保障,更要有实施、操作的高素质人员,才能保证高质量、低成本、造精品。

5、微生物:蛋白酶容易变味、发霉,生产过程的控制及及时清洁很关键,污染微生物影响活性和收率,所以清洁环节要认真控制。

参考文献:

1、王玉田.动物性副产品加工利用[M].化学工业出版社,2009.

2、李良铸.现代生化药物生产关键技术[M].化学工业出版社,2006.

3、袁勤生,赵健.酶与酶工程[M].华东理工大学出版社,2005.

4、王春艳,孙美华.药品生产质量管理规范[M].化学工业出版社,2020.

5、郭勇.酶的生产与应用[J].化学工业出版社, 2003.

作者简介:包前德门 1984.07.16 男 内蒙古通辽市 蒙古族 在职研究生 化工工程,中级 赤峰市云淞科技发展有限责任公司 研究方向:蛋白酶的生产与应用