气相色谱法检测啤酒中双乙酰含量方法探讨

气相色谱法检测啤酒中双乙酰含量方法探讨

李霞

麒麟啤酒（珠海）有限公司 519085

摘要：为避免因双乙酰含量检测不准确导致的发酵液降温时机过早或过晚，以及避免检测值和与品评馊味感官评价程度不相符问题，应采用高精度技术手段对啤酒中双乙酰含量进行检测，因传统蒸馏法的检测结果精准度不足，故本文提出运用气相色谱法检测啤酒中的双乙酰含量。基于此，本文首先对传统双乙酰蒸馏法进行评估，进一步指出气相色谱法在啤酒双乙酰含量含量中的应用要点，以期为同行啤酒双乙酰含量检测作业提供一定参考。

关键词：气相色谱法；啤酒；双乙酰含量

引言：双乙酰含量是啤酒生产过程中，发酵液是否达到降温条件的重要指标，且在生产实践中，有时会发现存在啤酒双乙酰检测结果与品评馊味感官评价程度不相符的现象，有时候酒液馊味较重，但其双乙酰含量检测结果较低；而有时候双乙酰含量检测结果较高，但感官评价无明显馊味。目前很多企业对双乙酰的检测方法仍是采用国标法中的蒸馏法，此法操作简单迅速，但检测结果为总连二酮含量，但具体采用的蒸馏装置略作形式上的改变，则企业间对标检测数据也有较大差异。针对上述问题，可革新检测理念，运用气相色谱法对啤酒双乙酰含量进行精准检测。

1.双乙酰蒸馏法的评估

1.1 问题提出

行内人士将双乙酰（2，3－丁二酮）和2，3－戊二酮统称为联二酮，均为氨基酸代谢的副产物，表现出奶油味、馊味等。一般而言，淡色啤酒中双乙酰的阈值为0.08～0.01ppm，而爱尔啤酒与司陶特啤酒中的双乙酰阈值约为0.1～0.4ppm。2，3－戊二酮的阈值为1ppm左右，由于双乙酰的阈值比2，3－戊二酮的阈值低得多，在此情况下，蒸馏法检测结果不能完全代表双乙酰的真正含量，且与品评结果也不相符[1]。故需要评估现双乙酰检测方法的准确性、其检验结果的代表性，并评估建立新的双乙酰检测方法的必要性。

1.2 蒸馏法评估

1.2.1 蒸馏法的不足

在啤酒贮存期间，双乙酰的前体物质α－乙酰乳酸氧化后会生成双乙酰，若其含量过高，会造成成品酒双乙酰反弹超标，高温、低PH值和氧的存在都有利于α－乙酰乳酸氧化成双乙酰。为此，我们将现双乙酰蒸馏法检测结果与同行进行对标，结果显示差异性较大，我们的检验结果偏低，且差异值相对较稳定，这意味着我们的检测条件（加热条件、蒸馏器具等）不是最优化的，需要改进[1]。

1.2.2 蒸馏法的原理

邻苯二胺与双乙酰反应，生成2，3－二甲喹喔啉，在335nm下有一最大吸收，可以对双乙酰进行定量测定，但其它联二酮类有相同的反应特性，因此测定结果为总联二酮含量。

1.2.3 蒸馏法应用步骤

（1）样品前处理。巴杀后啤酒常温放置，发酵液或巴杀前样品60℃水浴半小时。（2）药剂。4N盐酸、邻苯二胺溶液（当天配置）。（3）检测方法。①蒸馏：装好仪器并检查气密性，加热蒸汽发生瓶至沸，通汽加热蒸馏仪，备用；装有少量蒸馏水的25ml的比色管于冷凝管出口端，使馏出口尖端正好浸没至水面下；注入100ml样品， 迅速加入已先加热的蒸馏器内，进行蒸馏，直到馏出液达25ml刻度线；混匀馏出液，分别取10ml馏出液置于两比色管中，在一个样品中加入0.5ml邻苯二胺溶液，另一个样品作空白对照，充分混匀后置暗处20~30min。在样品中加入2ml 4N盐酸， 空白样中加入2.5ml 4N盐酸，混匀；用1cm比色皿，以空白作对照，在波长335nm处测定样品的吸光度。（显色完毕后30min内测定完毕；完成测定后，按照“联二酮(以双乙酰计，mg/l)=吸光度×2.4”方式进行计算。

1.2.4 实验结果与讨论

表1为同一样品巴前巴后的啤酒样双乙酰含量差异数据，结合表1不难看出，巴后啤酒双乙酰含量确实比巴前高，证明了双乙酰会反弹，高温、低pH值和氧的存在都有利于α－乙酰乳酸氧化成双乙酰。故发酵液等样品需进行前处理，保证全部双乙酰前驱物全部转变成双乙酰。以最保险的方法评估双乙酰含量。

表 1 巴前、巴后啤酒样双乙酰含量差异

蒸馏法馏出液接收方式是，先加入<2.5ml蒸馏水，使馏出口管口刚好浸在水下直接接收馏出液，无置于冰水浴中。同行中有部分企业操作方法是放在冰水浴中，但实验结果显示置于冰水浴中的检测结果偏低（见表2），故馏出液的接收方式维持现状。

表 2 馏出液接收方式的检测差异

蒸馏法应用期间，显色时应置于暗处，显色时间不能过长，控制在20～30min，一般控制在20min即可，显色时间过长，可能会出现正偏差，具体可见图1。

图 1 不同显色时间的双乙酰检测趋势

蒸馏法应用时比色测定最好在30分钟内完成，时间过长，会出现较大正偏差（见表3）。

表 3 比色测定放置时间的结果差异

目前发酵液或巴杀前啤酒检测前均需进行前处理，置于60℃水浴中30min，见表4，30min 已足够，即使延长时间，检测结果无较大变化。也尝试其它水浴条件，调整温度与时间，效果相差不大（见表5），故前处理维持现状已足够。

表 4 60℃水浴时间验证结果

表 5 其它水浴条件的结果

总之，蒸馏法检测双乙酰，方法参数设置已经是较优化了，因受方法本身限制，仍然无法解决问题的困扰，故需开发新的双乙酰检测方法——气相色谱法。

2. 气相色谱法检测啤酒双乙酰含量

2.1 检测原理

试样进入气相色谱仪中的色谱柱时，由于在气液两相中分配系数不同，而使双乙酰、2，3－戊二酮，2，3－己二酮及其它组分得以完全分离。利用电子捕获检测器捕获低能量电子，而使基流下降产生信号，与标样对照，根据保留时间定性，利用内标法或外标法定量。进入色谱柱前不经过加热处理，测得的是游离连二酮；于60℃90min后，测得的是包括前驱体转化在内的总联二酮。

2.2 仪器与药剂

2.2.1仪器设备

安捷伦气相色谱仪（ECD检测器、固定相为Carbowax 20M的毛细管色谱柱）、7694E自动进样器、高纯氮气瓶、空气瓶、20ml顶空样品瓶、 压盖器、20ml顶空样品瓶盖、10ul注射器、0.5-10ul移液枪

2.2.2仪器设备

超纯水、氯化钠、标准样品有（色谱纯）：双乙酰、2，3－戊二酮，2，3－己二酮。

2.2.3 可行性评估

检测要求的仪器设备除了固定相为Carbowax 20M的毛细管色谱柱外全都具备，国标推荐使用的Carbowax20M柱子为聚乙二醇(PEG)色谱柱，与其相似的柱子有DB-WAX，HP-INNOWax等，都为强极性的PEG柱，而后面两种柱子都具备，且考虑其接近程度与使用的方便性，建议先用DB-WAX柱实验，若分离效果不佳再实验使用HP-INNOWAX柱。

2.3 试剂溶液配制

2.3.1 2，3－己二酮的配制

（1）内标储备溶液：称取2，3－己二酮500mg，精确至0.1mg，用水溶解，并定容至100mL。该溶液在冷藏条件下可稳定1～2个月；（2）内标使用溶液：吸取内标储备溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。该溶液需当天用当天配。

对于2，3－戊二酮与双乙酰，其标准储备溶液和标准使用溶液的配制方法同2，3－己二酮，故不再赘述。

2.4 检测步骤

2.3.1 标准溶液的配备

在顶空取样瓶中装入水10ml和氯化钠4g，加入2，3－戊二酮、2，3－己二酮和双乙酰三种标准使用溶液各10ul，用衬有密封垫的铝压盖卷边密封。用手摇匀50s。该溶液所含三种标准物质的浓度各为0.05mg/L。若预计扩大线性响应范围连二酮（VDKs）含量0.05mg/l时，应适当调正标准溶液的浓度（如0.10、0.15、0.20mg/l），使响应值成线性。

2.3.2 试样的制备（样品前处理）

（1）啤酒样品的游离联二酮（VDKs）。取10mL室温下的啤酒样品（已吸去泡沫）于20ml顶空取样瓶中，加氯化钠4g和内标（2，3－己二酮）使用溶液10ul，用铝压盖密封。用手摇匀50s。（2）啤酒样品的总连二酮。在500ml三角瓶中，取啤酒样100ml，摇动除气后，取10ml酒样于20ml顶空取样瓶中，加氯化钠4g和内标（2，3－己二酮）使用溶液10ul，用铝压盖密封；于60度水浴中保温90min，冷却至室温后，轻轻拍打瓶盖使盖残留的液滴落下，用手摇匀50s。

2.3.3 测定

（1）顶空进样设置。顶空温度：样品瓶平衡温度30℃；定量环40℃；传输管线45℃。时间：样品瓶平衡时间，30.0min;充压时间，0.20min;定量环填充时间，0.20min;定量环平衡时间，0.10min;进样时间，1.00min。样品瓶压力：18.8Psi。（2）色谱条件。毛细管色谱柱：125-7032 DB-WAX 30m×0.53mm×1um (温度范围：20℃~240℃)（J&W）；柱温：55℃；进样口温度：150℃；检测器温度：200℃；载气（高纯氮）流量：5.0mL/min；应根据实际情况，通过试验选择最佳顶空与色谱条件，以使2，3－戊二酮、2，3－己二酮和双乙酰获得完全分离为准。（3）标准溶液的测定。将标准溶液顶空瓶放入顶空进样器，在设置好的顶空条件与GC条件下进行测定分析，记录2，3－戊二酮、2，3－己二酮和双乙酰峰的保留时间和峰面积。根据峰的保留时间定性。根据峰高（或峰面积），求得校正因子进行定量。作校正因子时，应反复进样分析三次，取平均值计算。（4）样品的测定。将制备好的试样放入顶空进样器，在选择好的顶空条件与GC条件下进行测定分析，记录2，3－戊二酮、2，3－己二酮和双乙酰峰的峰面积。根据校正因子进行计算含量。（5）分析结果表述。双乙酰按照式（1）进行校正计算，试样中的双乙酰（或2，3－戊二酮）按式（2）计算，计算所得结果均表示至二位数，同一试样两次测定值之差，不得超过平均值的10％。

                                                  （1）

式（1）中：f-双乙酰（或2，3－戊二酮）的校正因子；A1-内标的峰面积；A2-双乙酰的峰面积；d1-内标的密度；d2-双乙酰的密度。

                                                 （2）

式（2）中：X-试样中双乙酰的含量，mg/L；F-双乙酰的校正因子；A3-试样中双乙酰的峰面积；A4-添加于试样中内标的峰面积；C-添加于试样中内标的浓度，mg/l。

结束语：综上所述，国标法中的蒸馏法检测啤酒中双乙酰含量的结果为总联二酮含量，且检测结果受蒸馏装置影响较大，故极易导致检测差异，因此，为避免因双乙酰含量检测不准确导致的发酵液降温时机过早或过晚，以及避免检测值和与品评馊味感官评价程度不相符问题，可应用本文所提出的气相色谱法进行检测，并按照规范步骤精细化实施检测过程，借助气相色谱法得出啤酒值中双乙酰具体含量，以此提高啤酒双乙酰含量检测结果的可靠度。

参考文献：

[1]杨珍,贺立东.反吹-气相色谱法快速检测啤酒中的主要风味物质[J].中国酿造,2019,38(10):171-174.

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