赤霉素GA4+7发酵工艺优化研究-中国期刊网

赤霉素 GA4+7发酵工艺优化研究

聂志奎1 *，宋志远 1，聂波 1，周圣骄 1，陈涛涛 1，聂安辉 1

1江西新瑞丰生化股份有限公司江西新干 331300

摘要：赤霉素为植物五大激素之一，对植物生长具有多种生理作用，如调控植物的茎干延长、种子发芽、打破种子休眠、诱导开花等。目前赤霉素已经广泛应用于农业、林业、酿造业等，具有很大经济效益和市场前景。本文主要通过正交试验优化发酵配方，优化发酵参数条件以提高赤霉素的产量，降低发酵成本，促进赤霉素的大规模应用。

关键词：赤霉素、正交试验、GA4+7、植物生长调节剂

Abstract: Gibberellins are one of the classical five plant hormones, which has a variety of physiological effects on plant growth, such as regulating stem elongation, breaking seed dormancy, inducing flowering and so on. At present, gibberellins have been widely applied in agriculture, forestry and brewing industry, which thus has great economic benefits and market prospects. In this paper, gibberellins titer was improved by optimizing the fermentation process parameters and fermentation formula using orthogonal test method. These results are helpful to reduce the fermentation cost and promote the large-scale application of gibberellins.

Key words: gibberellin acid, orthogonal test method, GA4+7, plant growth regulator

赤霉素(Gibberellins，GAs)是一类属于双萜类化合物的植物激素，广泛存在于高等植物、真菌和细菌中。其种类繁多，目前已发现的赤霉素共有136种，总称为赤霉素类（GAs）。赤霉素类化合物作为植物生长调节剂有多种调节功能。在不同的光照、温度条件下以及植物生长的不同时期甚至同一植株的不同部位，产生的赤霉素各不相同。GA7主要产生在茎尖及未成熟的种子中，GA4在植物的根、茎、叶及种子中都有发现。在促进植物茎生长的活性上赤霉素表现为GA3＞GA7＞GA4。GA3因为活性太高，在打破植物休眠时会促进胚轴的过度生长，降低植株的抗倒伏性，同时还会促进表皮细胞的迅速生长，致使表皮角质层较薄，果实容易长斑破裂。GA7会强烈抑制花芽的形成，而GA4对花芽的形成不仅不会抑制反而具有促进作用。因此GA4+7混合可以起到优势互补作用，其较高的活性与独特的优势正受到越来越多的关注。

目前赤霉素GA4+7主要还是通过液体深层发酵法获得，但GA4+7的产量低，发酵水平在600mg/L 左右，生产成本高，严重阻碍了其大规模的商业化运用。国内外对于GA4+7的研究甚少，只有为数不多的几篇研究论文及专利，胡永红等通过在发酵培养基中添加混合碳源、在特定的时间添加植物油和特征性前体（氨基乙酸和甲羟戊酸）及提高通氧量以提高GA4+7的效价，发酵结束后GA4+7占70%左右，GA4:GA7为3:1左右，比例较高。而目前市场上需求的GA4+7混合物，二者比例在2:1时效果最佳，国外对赤霉素研究也主要集中在赤霉素GA3合成的机理研究，Tudzynski通过紫外诱变获得一株13-羟化酶突变株Gibberella fujikuroi 6314，发酵10 天GA7的产量达到790 mg/L，GA4 34 mg/L，GA3 35 mg/L，这是目前文献报道的GA7产量最高菌株，但是发酵周期长达10天。赤霉素GA4+7产品目前在苹果、梨等水果上颇具应用规模，国外市场赤霉素GA4+7市场容量在10吨以上，但由于生产成本高等原因，其赤霉素GA4+7原药只有美国有少量生产，国外的农作物主要用到GA4+7复配制剂，基本不生产GA4+7原药，国外一些发达国家的GA4+7制剂产业比较发达，目前GA4+7制剂生产所需的原药主要从中国购买，国内近年来所生产GA4+7原药产品主要销往国外。随着赤霉素GA4+7规模化生产、生产技术水平的提高、产品价格降低，国内使用的科学研究发展，赤霉素在苹果、梨上推广使用，其潜在的市场很大，前景十分看好，市场出现较大缺口。随着赤霉素GA4+7规模化生产、生产技术水平的提高、产品价格降低、国内使用技术的研究发展，市场前景十分看好。

1 材料与方法

1.1材料

菌株：藤仓赤霉菌NRF-793菌株。

斜面培养基(PDA培养基)：土豆、葡萄糖、琼脂等。

种子培养基：玉米淀粉、葡萄糖、花生饼粉、黄豆饼粉、磷酸二氢钾、硫酸镁等。

发酵培养基：玉米淀粉、葡萄糖、花生粉、黄豆粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙等。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶种子培养方法

500 mL三角瓶中装入种子培养基50 mL，将GA4+7菌株菌丝斜面挖块接种于摇瓶中，摇床转速220 r/min，温度(30±1) ℃恒温培养48 h左右。

1.2.2 摇瓶发酵培养方法

500 mL三角瓶中装入发酵培养基100 mL，将培养好的摇瓶种子液以10%的移种量移入发酵摇瓶中，摇床转速220 r/min，温度(32±1) ℃恒温培养120 h左右。

1.2.3 GA4+7效价测定—HPLC法

检测条件：色谱柱150 mm×4.6 mm，ODS-C18(5μm)；流动相为甲醇-水-甲酸(体积比67:33:0.05)，使用前超声波脱气；流速0.7 mL/min；检测波长210 nm；进样体积20μL。

效价计算：将测定2针试样溶液以及试样前后2针标样

溶液中GA4和GA7的峰面积分别平均，GA4和GA7的效价X₁

按下式计算：

X₁(GA4或GA7) =

GA4+7的效价X₂(mg/L) = X_GA4 + X_GA7

2. 结果与分析

2.1培养基优化实验

通常在发酵过程中，微生物细胞生长和维持除了需要碳源和氮源外，还需要向培养基中添加少量的营养因子，这些营养因子包括维生素、微量元素前提物质等，营养因子对菌体细胞代谢起关键作用的营养因子，所以对发酵过程十分有利。正交实验可以通过少数的实验次数找到较好的关键影响因子，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。

表1 正交实验设计及结果

组号	花生粉	黄豆粉	淀粉	KH₂PO₄	(NH₄)₂SO₄	GA4	GA7	GA4+7	比例
1	1.0%	0.5%	8%	0.15%	0.04%	403	220	623	1.8
2	1.0%	0.6%	9%	0.2%	0.08%	392	252	644	1.6
3	1.0%	0.7%	10%	0.25%	0.12%	384	265	648	1.5
4	1.0%	0.8%	11%	0.3%	0.16%	386	189	575	2.0
5	1.2%	0.5%	9%	0.25%	0.16%	438	246	684	1.8
6	1.2%	0.6%	8%	0.3%	0.12%	401	290	691	1.4
7	1.2%	0.7%	11%	0.15%	0.08%	458	218	676	2.1
8	1.2%	0.8%	10%	0.2%	0.04%	436	216	652	2.0
9	1.4%	0.5%	10%	0.3%	0.08%	400	267	667	1.5
10	1.4%	0.6%	11%	0.25%	0.04%	409	246	655	1.7
11	1.4%	0.7%	8%	0.2%	0.16%	373	132	505	2.8
12	1.4%	0.8%	9%	0.15%	0.12%	419	156	575	2.7
13	1.6%	0.5%	11%	0.2%	0.12%	433	146	579	3.0
14	1.6%	0.6%	10%	0.15%	0.16%	404	78	482	5.2
15	1.6%	0.7%	9%	0.3%	0.04%	418	213	631	2.0
16	1.6%	0.8%	8%	0.25%	0.08%	390	187	577	2.1
C	1.2%	0.6%	10%	0.225%	0.05%	348	261	609	1.3

对正交实验结果应用软件分析，分别对不同指标进行效应曲线分析，找到对不同因素的最优组合进一步验证。

表2 GA4+7方差分析表

变异来源	偏差平方和	自由度	方差	F值	Fa	显著水平
因素1	24912	3	8304	8.409	F0.01(3,9)=6.992	***
因素2	3802	3	1267.333		F0.05(3,9)=3.863
因素3	2543	3	847.6667		F0.1(3,9)=2.813
因素4	9676	3	3225.333	3.266	F0.25(3,9)=1.632	*
因素5	16939.5	3	5646.5	5.718		**
误差e	2543	3	847.6667
修正误差e	8888	9	987.5555
总和	60415.5

图1 GA4+7效应曲线

以总效价为研究对象，从上图效应曲线可以发现，因素1（花生粉）先升高后降低2水平最高，因素2（黄豆粉）浓度越高总效价越低，因素4（磷酸二氢钾）先升高后降低，因素5（硫酸铵）逐渐降低，对于总效价而言最优组合是A2B1C2D3E1。

表3 GA7方差分析表

变异来源	偏差平方和	自由度	方差	F值	Fa	显著水平
A	18023.19	3	6007.729	30.72	F0.01(3,6)=9.78	***
B	2606.188	3	868.7292	4.442	F0.05(3,6)=4.757	*
C	586.6875	3	195.5625		F0.1(3,6)=3.289
D	15414.19	3	5138.063	26.273	F0.25(3,6)=1.784	***
E	12003.69	3	4001.229	20.46		***
误差e	586.6875	3	195.5625
修正误差e	1173.375	6	195.5625
总和	49220.625

图2 GA7效应曲线

以GA7为研究对象，从上图效应曲线可以发现，因素1（花生粉）先升高后降低2水平最高，因素2（黄豆粉）浓度越高GA7越低，因素4（磷酸二氢钾）逐渐身高，但是升高的幅度越来越小，因素5（硫酸铵）先升高后降低，对于GA7而言最优组合是A2B1C2D4E2。

表4 比例方差分析表

变异来源	偏差平方和	自由度	方差	F值	Fa	显著水平
因素1	4.53	3	1.51	8.162	F0.01(3,9)=6.992	***
因素2	0.465	3	0.155		F0.05(3,9)=3.863
因素3	0.735	3	0.245		F0.1(3,9)=2.813
因素4	3.965	3	1.3217	7.144	F0.25(3,9)=1.632	***
因素5	3.245	3	1.0817	5.847		**
误差e	0.465	3	0.155
修正误差e	1.665	9	0.185
总和	13.405

图3 比例效应曲线

以比例为研究对象，从上图效应曲线可以发现，因素1（花生粉）浓度越高最终比例就越高，因素2（黄豆粉）也是水平越低比例越低，因素4（磷酸二氢钾）比例逐渐降低，说明磷酸二氢钾浓度越高比例会越低，因素5（硫酸铵）先略微降低再升高，对于比例而言最优组合是A1B1C2D4E2。

正交实验最优组合验证实验

表5正交实验验证实验

组号	花生粉	黄豆粉	淀粉	KH₂PO₄	(NH₄)₂SO₄	GA4	GA7	GA4+7	比例
1	1.2%	0.7%	11%	0.15 %	0.08%	435	205	640	2.1
2	1.2%	0.8%	10%	0.2 %	0.04%	414	233	647	1.8
3	1.2%	0.5%	9%	0.25%	0.04%	363	298	661	1.2
4-A7	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	378	315	693	1.2

重新做了四组验证实验，发现以A7为研究对象最优组合效价达到693 mg/L，比例为1.2，后期以这个配方进行工艺条件研究实验。

2.2 不同初始pH实验，考查不同初始pH对GA4+7发酵的影响

pH在调节微生物的代谢过程中起着重要的作用，尤其是在含有大量复合产物的发酵过程中，pH对发酵结果的影响尤为明显。赤霉素发酵过程中含有几种代谢类似物，如赤霉素GA3，赤霉素GA4，赤霉素GA7，赤霉素GA1。这些赤霉素相关酶最适pH并不一致，因而发酵过程中pH不仅会影响赤霉菌的生长，还会影赤霉素的代谢过程，一般中性条件下有利于积累赤霉素GA7，酸性条件下有利于积累赤霉素GA4。

表6 不同初始pH实验安排及结果

pH	花生粉	黄豆粉	淀粉	KH₂PO₄	(NH₄)₂SO₄	GA4	GA7	比例	GA4+7
4.0	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	390	122	3.2	513
4.5	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	356	212	1.7	568
5.0	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	298	336	0.9	634
5.5	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	276	365	0.8	641
6.0	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	285	343	0.8	628

图4 不同初始pH实验结果曲线

针对不同初始pH结果分析，总共考察了五个梯度pH，发现初始pH越低，发酵结束时pH值也更低，比如初始pH值4.0发酵结束时pH为3.37，发现pH值越低GA4水平越高，说明GA4在酸性条件更有利于产生，比对照组GA4效价水平都要高出100 mg/L，而GA7水平相反，pH值越低GA7水平越低，有可能是GA4 1,2脱不饱和酶在酸性条件下酶活较低，导致GA7水平低，因此赤霉素GA4+7发酵过程中前期pH设置低些，后期将pH水平调高，有利于GA7的合成，在初始pH为5.5时，水平和对照组相当，其他条件下水平比对照组要低。

2.3不同装液量实验

赤霉素发酵过程是需氧过程，整个发酵过程都需要充足氧气的供应。除了菌体正常生长所需的氧气，赤霉素的合成也需要大量氧气的参与。因为在赤霉素合成途径中涉及到许多氧化步骤，如细胞色素P450 单加氧酶、双加氧酶、脱氢酶所催化的反应都需要氧气的参与，所以在赤霉素生产过程合适的溶氧供给至关重要。当发酵过程中溶氧供应过低时会导致菌丝体内的代谢发生改变，厌氧呼吸产生大量对细胞有毒害作用的乙醇、乙酸等；同时赤霉素的合成受到抑制并产生大量的副产物；造成pH急剧下降，菌丝体自溶，发酵终止，从而产量偏低。但是发酵过程中并不是溶氧越高越好，当溶氧过高时，不但会造成溶氧过剩提高生产成本，而且也会造成一些副产物的大量合成如脂肪酸等，赤霉素的产量反而降低在摇瓶试验中我们可以通过不同装液量初步衡量溶氧对赤霉素GA4+7生物合成的影响。

表7不同装液量实验安排及结果

装液量	花生粉	黄豆粉	淀粉	KH₂PO₄	(NH₄)2SO4	GA4	GA7	比例	GA4+7
50ml	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	480	325	2.11	805
75ml	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	370	396	0.94	765
100ml	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	350	308	1.13	658
125ml	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	299	195	1.54	494

图5 不同装液量实验结果曲线

发现不同装液量对GA4+7影响比较显著，分别考察装液量10%，15%，20%，25%，效价和比例分别是805 mg/L，2.11；765mg/L，0.94；658 mg/L，1.13；494 mg/L，1.54，不同装液量对总效价影响很显著，装液量越大总效价越低，但是对比例影响不大，装液量在10%时总效价达到805，比装液量20%提高了22%，但是比例高，可能原因是，不同装液量主要是导致溶氧不同，溶氧对GA4的影响比较大，可能前期需要溶氧水平高，后期溶氧要求低，GA4的合成对溶氧要求高，可以考虑双阶段供养。

2.4不同大小玻璃珠实验

在微生物工业发酵过程中，深层通气搅拌发酵起着非常重要作用，其目的是使发酵体系气液两相充分混合接触，强化发酵过程的混合与传质，促进系统内培养基组分、温度、pH值和溶解氧等均匀分布，减少菌丝结块，保障菌体能够在发酵罐体内正常生长和代谢等。搅拌也有不利方面，高速旋转的搅拌器剪切菌丝，易造成菌丝体损伤，形成短矮的分支；降低搅拌转速后，菌丝又开始变的细长，又会导致溶氧供应不足，影响最终产物合成。搅拌最终与发酵生产能力和产品质量息息相关，是发酵过程优化控制的非常重要的一个参数。

本研究首先在发酵摇瓶中考察剪切力对赤霉菌生长及产物合成的影响，并根据摇瓶实验结果调整发酵过程搅拌控制策略。接种前，在发酵摇瓶中分别添加不同个数和不同直径的玻璃珠，考察添加不同个数玻璃珠对赤霉素GA4+7发酵的影响，以不添加玻璃珠为对照，发酵结束后取样测定赤霉素GA4+7效价，结果见图6 。

表8 不同大小玻璃珠实验安排及结果

玻璃珠	花生粉	黄豆粉	淀粉	KH₂PO4	(NH₄)₂SO4	GA4	GA7	比例	GA4+7
2mm-2	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	388	351	1.10	738
2mm-4	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	432	339	1.27	772
2mm-6	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	395	339	1.16	734
4mm-1	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	473	252	1.88	724
4mm-2	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	379	191	1.97	570
4mm-3	1.2%	0.5%	9%	0.30%	0.08%	374	179	2.09	553
control	1.2%	0.6%	10%	0.225%	0.05%	306	346	0.89	653

图6 不同大小玻璃珠实验结果曲线

考察了添加两种不同规格的玻璃珠对GA4+7发酵的影响，最初的想法是想了解菌丝体耐剪切力程度，通过实验结果发现，添加一定数量直径较小的玻璃珠对GA4+7的合成具有促进作用，当添加玻璃珠直径较大时，玻璃珠对菌丝体损伤作用可能较大，当添加2mm作用玻璃珠4颗时总效价达到最高772比对照组653提高了18%，真菌体系发酵，菌丝体的形态对发酵结果也有一定的影响，比如黑曲霉成球时有利于柠檬酸产生，成菌丝状时有利于产酶，我们这个体系也可能是成一定的菌丝状更有利产物的产生，当剪切过大，菌丝体被切得很碎时又不利于产物的产生，要寻找到最有利于产物合成时菌丝形态。

结论：本文以藤仓赤霉菌为研究对象，通过正交试验获得一组最优配方，并优化了发酵参数，发现初始pH，不同溶氧条件和剪切大小对赤霉素GA4+7的合成都有影响，为后期中试和生产试验提供了试验依据。

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1 基金项目：江西省科技厅重点研发项目（项目编号：20181BBF60029），江西省首批培养类科技创新高端人才（青年）项目（项目编号：jxsq2019201089）

作者简介：聂志奎，男，1985，江西吉安人，主要从事微生物发酵代谢调控

^*通讯作者：聂志奎E-mail: nzk1986@126.com

赤霉素GA4+7发酵工艺优化研究