高通量测序检测肝癌患者血浆循环核酸p53基因突变的研究

高通量测序检测肝癌患者血浆循环核酸p53基因突变的研究

陈静

陈静

【摘要】目的分析讨论血浆循环核酸p53突变诊断监测原发性肝癌的价值。方法2013年5-6月原发性肝癌患者25例为观察组，乙型肝炎患者30例为对照组，提取血浆循环核酸，用第二代高通量测序技术对p53基因全外显子进行测序，检测其变异情况。结果观察组患者p53基因6号外显子突变比例最高为24.0%，外显子3、4、5、7的突变比例分别为4.0%、12.0%、8.0%、4.0%。对照组患者p53基因突变率为16.7%、观察组患者p53基因突变率为52.0%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论原发性肝癌患者的血浆循环核酸p53突变率较高，可作为临床诊断监测的重要指标。

【关键词】血浆循环核酸p53；基因突变；原发性肝癌；高通量测序

近年来，我国原发性肝癌的发病率逐年上升，且以男性患者居多，发病原因与机制尚在研究当中，临床推断发病多数由乙肝慢性感染、丙肝、肝硬化等疾病转化引起[1]。多数患者在发病初期即表现为肝区疼痛，若出现肿瘤结节破裂，还可能出现腹腔内出血等全身性表现[2]。临床上对于原发性肝癌的检测，以血清肿瘤标志物甲胎蛋白等检测与影像学超声检查为主，为了研究血浆循环核酸p53突变诊断原发性肝癌的价值，利用第二代高通量测序技术[2]对肝癌患者血浆进行了检测，乙型肝炎患者血浆作为对照组，现报告如下：

资料与方法

1.临床资料

2013年5-6月间，第二军医大学第三附属医院接收原发性肝癌患者25例为观察组，其中男性14例，女性11例，均由术后病理检测确诊为原发性肝细胞癌，年龄43-78岁之间，平均年龄（63.7±4.15）岁，病程1-9年，平均病程（4.66±0.63）年；选择乙型肝炎患者30例为对照组，其中男性16例，女性14例，均由临床结合血清学检查确诊，年龄41-77岁之间，平均年龄（61.6±5.73）岁，病程1-8年，平均病程（4.21±0.72）年。两组患者均不存在其他相关疾病干扰及重要脏器损伤，两组患者在一般资料上差异不明显（P＞0.05），具有可比性。

2.血浆游离DNA提取方法

采集两组患者晨起餐前静脉血5毫升，应用EDTA钠盐抗凝，4000转/分钟离心5分钟后，提取上层血浆放置于-20℃冰箱保存。用蛋白酶K及RNaseA对分离后的血浆进行处理，然后根据QIAampcirculatingnucleicacidkit（Qiagen,美国）试剂盒的说明，对血浆游离DNA进行提取，提取后的DNA由Qubit2.0荧光计（Thermo,美国）进行定量。

3.高通量测序方法

p53基因全外显子高通量测序引物由LifeTechnologies（美国）设计并合成；从每个样本提取的血浆游离DNA中，各取150ng分别加上特定的barcode，预扩增建库，用IonOneTouch2System对10pm/样本的预扩增库进行乳滴PCR后，加入Ion318?芯片用IonPGM测序仪进行测序。高通量测序数据由VariantCaller4.0软件进行分析后，p53基因的突变通过IGV2.3（Broad研究所）进行对比。测序平均覆盖率≥25000X，当突变频率≥5%时记为阳性突变。

4.观察指标

比较原发性肝癌患者血浆循环核酸p53基因各外显子突变高通量测序结果，及对照组、观察组患者血浆循环核酸p53突变比例。

5.统计学处理

采用SPSS20.0统计学软件包进行统计学分析、处理，计量资料用±s表示，计数资料用百分率（%）表示，组间计量资料比较采用两样本t检验，组间计数资料的比较采用x2检验，以P＜0.05为差异说明有统计学意义。

结果

1.原发性肝癌患者血浆循环核酸p53基因外显子突变测定结果

25名原发性肝癌患者中共计13例的血浆循环核酸p53基因的外显子发生突变，外显子3-7中以外显子6突变率最高，为24.0%，详细结果见表1：

讨论

肝部恶性肿瘤在我国发病率较高，以原发性肝细胞癌更为常见，发病后病死率高，易复发转移。而目前肝癌临床血清学诊断和影像学判断均存在一定的漏诊率和假阳性率，因此寻找新的血清学诊断指标是提高肝癌诊断准确率的有效策略，同时开展血清循环肿瘤核酸突变的筛查，会为后续抗肿瘤复发转移，寻找合适的靶向治疗药物提供可能[3]。

为了研究血浆循环核酸p53基因突变诊断原发性肝癌的价值，我们采用了第二代高通量测序技术，对乙肝感染对照组及肝癌观察组患者血浆循环核酸p53基因的全外显子进行了测序分析。发现对照组患者循环血中p53基因突变率仅为16.7%，而观察组患者中则高达52.0%，具有显著性差异（P＜0.05）。作为抑癌基因，p53基因若发生突变或缺失，可影响DNA的正常修复功能，并对细胞生长及恶性转化起到促进作用，并最终导致肝癌的形成[4]。目前临床主要将p53基因的突变检测应用于术后病理组织中，同时也有通过免疫组化方法对P53蛋白水平进行检测。而由于病理标本取材复杂且极易被正常细胞核酸污染，以及该方法本身属于侵入式检测，对于无法手术的患者不能开展相关检测。而通过检测血浆中循环核酸p53，仅通过采集外周血即可，早期病人和手术后患者均可进行检测，适用范围更广，将有可能应用于术后复发转移、用药反应性的动态高通量监测。

综上，对于原发性肝癌患者，其血浆中血浆循环核酸p53突变率较高，可用于临床监测。

参考文献

[1]WangHY,ChenL.Tumormicroenviromentandhepatocellularcarcinomametastasis[J].JGastroenterolHepatol.2013,28Suppl1:43-48.

[2]RothéF,LaesJF,LambrechtsD,etal.PlasmacirculatingtumorDNAasanalternativetometastaticbiopsiesformutationalanalysisinbreastcancer[J].AnnOncol.2014,25(10):1959-1965.

[3]HamakawaT,KukitaY,KurokawaY,etal.MonitoringgastriccancerprogressionwithcirculatingtumourDNA[J].BrJCancer.2015,112(2):352-356.

[4]WangX,SimpsonER,BrownKA.p53:ProtectionagainstTumorGrowthbeyondEffectsonCellCycleandApoptosis[J].CancerRes.2015,75(23):5001-5007.