DNA分子标记在中药鉴定中的应用进展

DNA分子标记在中药鉴定中的应用进展

海学忠

海学忠（宁夏吴忠市利通区马莲渠乡卫生院751100）

【摘要】DNA分子标记包括以分子杂交（southern杂交）为基础的DNA分子标记技术、以PCR为基础的DNA分子标记技术和以DNA序列为基础的分子标记技术和DNA序列测定技术。本文概述了常用DNA分子标记技术的特点，对近年来DNA分子标记在中药鉴定中的应用进行了综述。

【关键词】DNA分子标记中药鉴定AFLPRAPDDNA序列测定

DNA分子标记技术也称DNA分子诊断技术，是基于研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性。检测这种多态性的技术，亦即DNA分子标记技术，大致可分为三类：第一类是以分子杂交技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段长度多态性）；第二类是以PCR技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段长度多态性）、RAPD（RandomAmplifiedPolymorphismDNA，随机扩增长度多态性）；第三类以DNA序列为核心的分子标记技术，其代表性技术有rDNAITS（internaltranscribedspacers）测序分析技术。

药用植物是中药材的主要来源，中药材的研究与利用在中国具有数千年的历史，是中华文化的瑰宝。当前，中药正逐渐走向国际化，但中药的源头普遍存在着来源混乱、真伪难辨等现象，造成了药材质量不稳定，难以保证临床用药的安全、稳定和有效，传统的中药材研究与利用方法尽管为中国及一些亚洲国家或地区的多数人所接受，但却难被国际广泛认可。因此，严重影响了中药打入国际市场。近年来，DNA分子标记技术快速发展并在中药鉴定中不断得到发展与应用，本文综述了近年来DNA分子标记技术在中药鉴定中的应用进展。

1．RFLP分子标记

RFLP是上世纪八十年代中期发展起来的一种最早的分子标记。RFLP是由于DNA分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位点的增减所引起的基因型间限制性片段长度的差异。它的基本原理是：不同材料的DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所分析的DNA序列间的RFLP。1996年，Mizukami对分布于日本的三岛柴胡（BupleurumolcatumL.）的3个地理种群进行了分类学研究，用水稻cDNA探针杂交，从12种限制性内切酶中筛选出3种具有鉴别意义的酶，经聚类分析，将三个地理种的柴胡分为2组，与形态学、细胞学和化学成分研究得出相同的结果[1]。赵宣等人用此方法成功的分析了牡丹组植物种间的关系，并获得了相应的分子证据[2]。但RFLP分子标记研究费用高，样品需用鲜材料，费时费力，所需DNA模板质量要求高、用量大等不足之处，限制了其在中药鉴定领域的发展与应用，近年来相关的研究报道较少。

2．AFLP分子标记

AFLP是1993年由荷兰keygene公司科学家Zabeau等人发明的一种DNA分子标记技术，其基本原理是：对基因组DNA进行限制性酶切片段的选择性扩增。主要步骤是：将基因组DNA进行限制性酶切后，将特定的接头连接在DNA酶切片段的两端，从而形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3′端的识别，进行PCR扩增，最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染或放射自显影检测。

王晓梅等[3]检测了雌雄银杏基于DNA的差异，筛选出与银杏性别有关的分子标记，其中3个引物组合各提供了1个与雌性相关的标记，这为寻找性别特异的探针或PCR引物，用于银杏性别鉴定奠定了基础。虞泓等[4]用AFLP技术对石解属内石解组4个种和1个外类群种进行基因组DNA多态性分析，从64对引物组合中选出5对引物组合构建了5个种的DNA指纹图谱。实验采用AFLP技术对石解属4个种（共20个样品）和1个外1类群种（共5个样品）进行了基因组DNA多态性分析，构建了药用石解的DNA分子指纹图谱，该技术对石解属种的鉴定及彼此亲缘关系的分析具有快速、准确、可信度高的特点。

AFLP标记具有稳定性强、重复性高的特点，一套引物能用于一切物种，易于实现自动化。但由于该项技术申请了专利，其分析试剂盒价格贵，实验技术复杂，对DNA纯度和内切酶质量要求高，从而限制了它的商业开发应用。

3．RAPD分子标记

RAPD是建立在PCR技术基础上，由美国Williams等人1990年发明的一种新型分子标记技术。它是以一系列不同碱基的随机排列的寡核苷酸单链为引物（一般10碱基），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物片段的多态性，也就反映了基因组相应区域的DNA片段多态性。这种标记在不需要知道DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹模式，而且需要DNA量少，可以产生丰富的多态性，操作简便易行。

Shaw[5]等用RAPD方法对人参、西洋参、三七及伪品进行鉴别，根据扩增产物，就能有效地鉴别三种药材。邵爱娟等对人参栽培群体进行了RAPD分析，共筛选出18个随机引物用于PCR扩增，其中17个供试样品共获得145条扩增片段，其中有53条是多态的，占36.5%。聚类分析结果表明，大马牙类型内各品系间的亲缘关系近于二马牙类型各品系间的亲缘关系，从分子水平上证明根据表征性状对栽培类群进行划分是可行的[6]。马小军[7-8]等利用RAPD、AFLP标记对人参、圆参与山参品种的研究中发现，RAPD、AFLP标记可以用于野生与栽培品种的鉴别，其长脖类型更接近野生人参。陈永久等用RAPD标记分析了冬虫夏草的遗传分化，从分子水平刻画虫草遗传进化、亲缘关系与地理分布的关系，为虫草资源利用与保护提供了依据[9]。郭宝林等[10]利用RAPD技术探讨了中药厚朴种内关系和道地性问题，并将所得结果与形态学及指标成分相联系，最终认为厚朴应分为3个地理综，道地性主要来源于遗传变异。RAPD技术已成为在中药材鉴定中应用最为广泛的DNA分子标记技术，目前研究涉及的中药还有淫羊藿、甘草、石斛、黄连、牛膝、地黄、溪黄草、细辛、大麻、当归、贝母、党参等药材的鉴定。

虽然RAPD在中药种质研究上的应用最为广泛，但其最大的缺点是引物为单链且短，对反应条件较为敏感，重复性差，从而限制了其发展[11]。

4．DNA序列测定

DNA序列分析（DNAsequencing）的发明使DNA分子鉴定技术取得了突破性进展。首先测定目的基因片段核苷酸序列，然后通过比较序列间的差异来确定各分类群有鉴别意义的特异性位点。它的研究对象主要是短片段的DNA，因此模板的降解程度对扩增及测序结果的影响不大，具有较好的稳定性和重复性。目前进行DNA测序的基因主要有用于植物类药材的叶绿体基因组rbcL基因、trnK及其内含子matK基因、rpl基因与核基因组核糖体DNA18S、ITS、5SRNA基因，以及用于动物类药材鉴定的线粒体基因组cyt-b、12SrRNA基因等。

在已有的研究基因中rDNAITS序列是应用比较多的基因片段，丁小余等[12]对中药黄草石斛（Dendrobiumchrysanthum）序列进行分析，发现ITS1、ITS2两段序列在石解种内保守种间差异较大，可以作为黄草石斛分子鉴定的标记。另有报道，对16种石斛内转录间隔区ITS2进行了DNA测序，结果表明，种间差异百分率平均为12.4％，与外类群（石仙桃属）及杂质（掺杂物）的差异百分率分别为29.8％和18.8％，而种内的差异百分率只有1％，认为ITS2区可作为区分石斛种间、石斛与外类群的分子标记[13]。刘春生等[14]在获得北细辛、华细辛和汉城细辛完整的rDNAITS序列，研究发现中药细辛3种原植物形成非常稳定的独立分支（其中北细辛与华细辛聚在一起，汉城细辛形成另外一个分支），但三者亲缘关系非常密切，说明它们相互替代入药是有遗传基础的。丁平等对巴戟天及其常见混伪品的rDNAITS进行了PCR扩增、测序，并运用CLUSTALX、MEGA软件对该区进行序列分析。根据ITS序列特征构建了系统树，混伪品假巴戟天与羊角藤首先聚类，然后与巴戟天聚在一起，而虎刺则单独聚为一支。证明了rDNAITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法[15]。

5．讨论

近年来，分子生物学技术中DNA指纹图谱的不断发展与完善，把种质资源的研究提高到一个崭新的水平。该技术不受时间、环境条件限制，特别是可以从中药干品甚至炮制品中提取少量DNA用于分子鉴别，结果精准、快捷，受到中药工作者的青睐[16]。已有的研究结果表明，以DNA分子遗传标记作为鉴定特征的中药DNA分子鉴定与经典的中药鉴别方法相比具有特异性强、稳定性好、微量、便捷、准确等特点。随着分子标记技术的日益成熟，有可能在基因组上寻找多态位点，用以揭示属间、种间、居群间甚至个体间的遗传变异，从而指导人们在植物居群生物学、保护生物学、系统生物学等领域开展研究，并在良种培育以及遗传资源研究、保护和利用过程中采取积极有效的措施。

参考文献

[1]徐红，王峥涛，胡之璧等.中药DNA分子鉴定技术的发展与应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2003，5（2）：24-30.

[2]赵宣，周志钦.芍药属牡丹组（Paeoniasect.Moutan）种间关系的分子证据：GPAT基因的PCR.RFLP和序列分析[J].植物分类学报，2004，42（3）：236－244.

[3]王晓梅，宋文芹，刘松等.利用AFLP技术筛选与银杏性别相关的分子标记[J].南开大学学报（自然科学版），2001，34（1）：5-9.

[4]虞泓，和锐，倪念春等.石斛属4种植物的AFLP分析[J].中草药，2004，35（7）：808-810.

[5]ShawPC，ButPPH.AuthenticationofPanaxSpeciesandTheirAdultrantsbyRandomprimedPolymeraesChaingReaction[J].PlantaMed，1995，61：466-470.

[6]邵爱娟，李欣，黄璐琦等.用RAPD技术对人参栽培群体的遗传分析[J].中国中药杂志，2004，29（11）：1033－1036.

[7]马小军，汪小全，徐昭玺等.人参不同栽培群体遗传关系的RAPD分析[J].植物学报，2000，42（6）：587-590.

[8]马小军，汪小全，肖培根等.人参农家类型的AFLP指纹研究[J].中国中药杂志，2000，25（12）：707－710.

[9]陈永久.冬虫夏草的随机扩增多态DNA及其遗传分化[J].遗传学报，1997，24（5）：410-412.

[10]郭宝林，吴勐，斯金平等.厚朴DNA分子标记的研究—正品的RAPD研究[J].药学学报，2001，36（5）：386-388.

[11]王和勇，罗恒，孙敏.RAPD在中药材鉴别中的稳定性和可靠性[J].中药材，2004，27（1）：63－66.

[12]丁小余，徐路珊，徐红等.曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和DNA分子证据[J].药学学报，2001，36（11）：868-873.

[13]徐红，李晓波，丁小余等.中药黄草石斛rDNAITS序列分析[J].药学学报，2001，36（10）：777-783.

[14]刘春生，白根本，阎玉凝.基于核DNAITS序列的细辛药材基源及分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2005，30（5）：329-331.

[15]丁平，方琴.巴戟天与常见混伪品的rDNAITS序列分析及其分子鉴定[J].中草药，2005，36（6）：908-911.

[16]应依，徐红，王峥涛.DNA分子标记技术在中药石斛类药材鉴定中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（3）：65-70.