EB病毒相关胃癌组织中NF-κB及bcl-2蛋白表达的研究

EB病毒相关胃癌组织中NF-κB及bcl-2蛋白表达的研究

文亦磊叶星江

文亦磊叶星江

(西中医药大学第一附属医院病理科530023)

【摘要】目的探讨NF-κB及bcl-2蛋白在EB病毒相关性胃癌(EBVaGC)与非EB病毒相关性胃癌(EBVnGC)中的表达及意义。方法应用原位杂交技术(ISH)检测84例胃癌组织中EB病毒小RNA(EBER)表达情况；应用免疫组织化学方法(S-P法)检测84例胃癌组织中NF-κB及bcl-2蛋白表达情况。结果⑴9例(10.7%)胃癌组织EBER原位杂交阳性，属于EBVaGC；75例(89.3%)胃癌组织EBER原位杂交阴性，属于EBVnGC。⑵9例EBVaGC中7例(77.8%)NF-κB表达阳性，75例EBVnGC中28例(37.3%)NF-κB表达阳性，NF-κB的表达在EBVaGC及EBVnG间存在差异(P＜0.05)；⑶9例EBVaGC中6例(66.7%)bcl-2表达阳性，75例EBVnGC中38例(50.7%)bcl-2表达阳性，bcl-2的表达在EBVaGC及EBVnG间无明显差异(P>0.05)。结论EBVaGC中NF-κB蛋白的高表达，提示EB病毒可能通过影响细胞转录调控而参与了EBVaGC发生、发展的过程。

【关键词】EB病毒相关性胃癌；非EB病毒相关性胃癌；NF-κB；bcl-2

基金项目：广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(合同号：Z2011113)EB病毒(EBV)属于DNA疱疹病毒，该病毒编码大于85个基因组，大部分人群都感染过EB病毒，而且EB病毒与很多淋巴源性及上皮源性肿瘤密切相关。有研究表明，约有10%的胃癌与EB病毒感染有关[1]，故这类胃癌又被称为EB病毒相关性胃癌(EBVaGC)。NF-κB作为重要的转录调控因子，起着核心枢纽作用，它可以调控很多基因表达，而这些基因又与细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应、转化有着密切的联系；bcl-2能抑制细胞凋亡，延长细胞生存期，进而引发肿瘤。胃癌的发生、发展是一个多步骤、多因素影响的过程，涉及的机制非常复杂，本文通过原位杂交方法检测胃癌中EBER表达情况及免疫组化方法检测NF-κB和bcl-2的表达情况，探讨它们与胃癌临床病理特征的关系及意义。

1材料与方法

1.1一般资料选择广西中医药大学第一附属医院2008年1月～2013年6月手术切除并经病理检测证实为胃癌的蜡块标本84例，所有病例术前均未进行放疗、化疗，病理类型均为腺癌。其中男性48例，女性36例；年龄32～87岁，平均年龄56岁。

1.2EBER原位杂交EBER原位杂交试剂购于PanPath公司。组织蜡块切成4um粘附于防脱片上，常规脱蜡及水化，蛋白酶K消化。滴加适量杂交液，55℃下孵育1.5小时，转移至37℃下孵育12小时，PBS浸泡洗涤，滴加适量一抗，于37℃下孵育30分钟，拭去组织周围的液体，滴加适量二抗，于室温下孵育20分钟。拭去组织周围的液体，滴加适量HRP聚合物，室温下孵育30分钟，PBS浸泡洗涤后滴加适量DAB显色液，在室温下孵育约3-10分钟，同时在镜下观察显色程度。

1.3免疫组织化学法NF-κB及bcl-2单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。5μm厚切片。常规脱蜡水化后，柠檬酸高压修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，其余步骤按试剂盒说明进行操作。用PBS替代一抗作为阴性对照，用已知阳性片作为阳性对照。

1.4结果判读EBER原位杂交结果判定：EBER阳性表达于细胞核，呈棕黄色。免疫组化采用Volm使用的半定量法[2]：NF-κB阳性表达部位为胞质和(或)胞核，bcl-2阳性表达部位为胞质和(或)胞膜。1.5统计学分析应用SPSS15.0软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1EBER在胃癌组织中的表达84例胃癌组织中9例(10.7%)胃癌组织EBER原位杂交阳性，属于EBVaGC(见图1)；75例(89.3%)胃癌组织EBER原位杂交阴性，属于EBVnGC。

2.2NF-κB在胃癌组织中的表达9例EBVaGC中7例(77.8%)NF-κB表达阳性(见图2)，75例EBVnGC中28例(37.3%)NF-κB表达阳性，NF-κB的表达在EBVaGC及EBVnG间存在差异(P＜0.05)(详见表1)。

2.3bcl-2在胃癌组织中的表达9例EBVaGC中6例(66.7%)bcl-2表达阳性(见图3)，75例EBVnGC中38例(50.7%)bcl-2表达阳性，bcl-2的表达在EBVaGC及EBVnG间无明显差异(P＞0.05)(详见表1)。

3讨论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在消化道的恶性肿瘤中居首位。主要分布在亚洲、拉丁美洲和中欧地区，我国胃癌发病率很高。胃癌的发生与发展是一个复杂的过程，涉及基因异常表达、细胞传导异常及细胞凋亡抑制等机制。EB病毒是与人类关系最密切的病毒之一，而且它与很多恶性肿瘤关系密切，例如鼻咽癌、伯基特淋巴瘤等等。自1991年Shibata等[3]首次在胃癌细胞中发现EB病毒以来，EB病毒相关性胃癌逐渐成为研究热点，国外研究报道胃癌EBV感染检出率7.3%~16.9%[4]，而且不同地区胃癌中EB病毒感染率存在明显差异。本研究中84例胃癌标本，有9例胃癌EBER阳性，阳性率为10.7%，与文献报道相符。在实验中发现，胃癌里大部分癌细胞都有EBER表达，由此推测EB病毒感染可能在EBVaGC形成早期发挥作用---感染了EB病毒的肿瘤细胞发生单克隆性增殖，最后促使癌变进一步发展并导致几乎所有癌细胞均有EBER表达，这提示EB病毒与胃癌发生有密切关系。正常时，位于胞浆内的NF-κB与NF-κB活性抑制因子IκBα相结合，这样NF-κB的Rel同源区域会被IκBα遮盖住，从而不能进入细胞核内发挥它的生物活性作用。当具备某些作用因素时，如在病毒感染、细菌内毒素和自由基等的影响下，IκBα被磷酸化然后发生降解，NF-κB与其抑制因子IκBα发生解离，使得NF-κB可以从细胞核外进入细胞核内，进而启动某些具有κB位点的基因转录表达，发挥其调控细胞增殖、分化、凋亡、转化的作用。本研究显示，9例EBVaGC中7例(77.8%)NF-κB表达阳性，75例EBVnGC中28例(37.3%)NF-κB表达阳性，NF-κB的表达在EBVaGC及EBVnG间存在差异(P＜0.05)，EB病毒很有可能使作为始动因素激活了重要转录调控因子NF-κB，NF-κB再进一步调控下游基因蛋白的表达，通过不同的途径在细胞增殖和肿瘤发生发展中对胃癌的演进发挥了作用。1988年Vaux等首次报道bcl-2能够抑制细胞凋亡，延长细胞生存期，进而引发肿瘤。其他许多实验也表明，bcl-2基因主要是通过抑制细胞凋亡和延长细胞生存期发挥作用。研究发现bcl-2发挥其抗凋亡作用的主要机制包括：①bcl-2可以维持线粒体的稳定进而保护线粒体不受过氧化物的损伤；②bcl-2蛋白还可改变Ca2+的浓度来抑制凋亡发生；③bcl-2蛋白还可拮抗bax的促凋亡作用；④bcl-2蛋白可调控其他蛋白进而调节细胞周期中的核-胞浆转运。本研究中，9例__________EBVaGC中6例(66.7%)bcl-2表达阳性，75例EBVnGC中38例(50.7%)bcl-2表达阳性，bcl-2的表达在EBVaGC及EBVnGC间无明显差异(P＞0.05)，推测bcl-2对细胞凋亡抑制的影响在EBVaGC及EBVnGC间都发挥了作用，因此在两组间并未表现出统计学差异。

综上所述，胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤的过程，而EBVaGC中NF-κB蛋白表达高于EBVnGC，提示EB病毒通过对细胞转录调控的影响参与了这个过程。本研究中收集的EBVaGC例数有限，而且目前对于胃癌组织中EB病毒、NF-κB、bcl-2的相关研究不多，后期我们会加大样本进一步研究，以期为胃癌的诊治、预后判断提供更多的帮助。

参考文献

[1]TakadaK.Epstein-Barrvirusandgastriccarcinoma[J].MolPathol，2000，53(5):255-261.

[2]VolmM，KoomagiR，MatternJ.PrognosticvalueofvascularendothelialgrowthfactoranditsreceptorFlt-1insquamouscelllungcancer[J].IntJCancer，1997，74:64-68.

[3]ShibataD，TokunagaM，UuemuraY，etal.AssociationofEpstein-Barrviruswithundifferentiatedgastriccarcinomaswithintenselymphoidinfiltration[J].AmJPathol，1991，139(3):467-474.

[4]TrimecheM，KsiaaF，ZiadiS，etal.PrevalenceandcharacteristicsofEpstein-Barrvirus-associatedgastriccarcinomasinTunisia[J].EurJGastroenterolHepatol，2009，21(9):1001-1007.