两种方法测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量的比较

两种方法测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量的比较

连燕娜赵楠通讯作者洪庆福

（华北制药金坦生物技术股份有限公司,河北石家庄050035）

摘要：目的比较比色法和高效液相色谱法两种方法测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量的差异。方法采用比色法和高效液相色谱法分别测定3批重组人促红素注射液中枸橼酸离子的含量和两种方法检测的回收率，并用配对t检验检测两种方法的6统计学差异。结果比色法和高效液相色谱法检测重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量的检测结果是一致的，两种方法检测同一种供试品的检测结果无统计学差异(P>0.05)，检测回收率也无统计学差异(P>0.05)。结论测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量可选用比色法和高效液相色谱法中任意一种方法。但比色法检测中，用到吡啶、醋酸酐等有毒有害试剂，对环境及人身都有危害，而高效液相色谱法不存在这方面的问题。

关键词:重组人促红素注射液；枸橼酸离子含量；比色法；高效液相色谱法。

重组人促红素(rHuEPO)是一种刺激红细胞生成的糖蛋白,主要用于治疗肾性贫血[1]。枸橼酸钠是组成重组人促红素注射液缓冲液的主要成分之一，对于维持溶液的pH、渗透压等起着至关重要的作用，但枸橼酸钠也有可能引发患者的中毒反应[2]，因此枸橼酸离子含量的测定即成为其质量控制指标之一。目前，测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量常用的方法为比色法和高效液相色谱法[3-4]，但两种方法的检测结果是否有差异尚未有报道，因此，本研究主要比较了这两种方法的检测结果，为枸橼酸离子含量检测的方法选择提供理论依据。

1.材料和方法

1.1药品与试剂

供试品：重组人促红素注射液，华北制药金坦生物技术股份有限公司；枸橼酸钠标准品：美国USP药典标准品；其它试剂均为分析纯。

1.2仪器设备

紫外可见分光光度计：

高效液相色谱：Waterse2695

1.3方法

1.3.1比色法

枸橼酸钠对照品溶液的制备取枸橼酸钠0.6g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用5%三氯乙酸稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备精密量取供试品0.5ml与水4.5ml，加10%三氯乙酸溶液5ml，混匀，置60℃水浴加热5分钟，以每分钟4000转离心20分钟，取上清液备用。

测定法精密量取供试品溶液1ml，置25ml具塞试管中，精密加吡啶1.3ml，混匀，再精密加醋酸酐5.7ml，立即混匀并置31℃±1℃的水浴中，准确放置35分钟后，在波长425nm处测定吸光度。另精密量取枸橼酸钠对照品溶液0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.0ml，分别置于具塞试管中，各精密加5%三氯乙酸溶液0.75ml、0.50ml、0.25ml、0.00ml（其相对应的枸橼酸离子含量为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L），自“精密加吡啶1.3ml”起，同法操作。以对照品溶液枸橼酸离子浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液中的枸橼酸离子含量（mmol/L），再乘以供试品稀释倍数（20），即为供试品枸橼酸离子含量（mmol/L）。

1.3.2高效液相色谱法

色谱柱：苯乙烯—二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱（H+），内径7.8mm、柱长300mm、粒度10μm（或9μm、8μm）；柱温：50℃；流动相：0.004mol/L硫酸溶液临用前用0.45μm膜过滤；流速：0.8ml/分钟；进样量：20μl；检测时间：10分钟。

标准溶液制备：分别精密量取1.0、2.0、3.0ml的枸橼酸离子贮备液，加注射用水稀释至5ml，摇匀，即得相对应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸橼酸离子对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取供试品1ml，置15ml离心管中，精密加1.5%磺基水杨酸溶液1ml，混匀，室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清检测。

以对照品溶液枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程。计算供试品溶液枸橼酸离子含量（mmol/L），再乘以相应的供试品稀释倍数（5），即为供试品枸橼酸离子含量（mmol/L）。

1.3.3两种方法检测结果比较

用两种方法分别检测3批供试品溶液中枸橼酸离子的含量，重复检测三次，比较两种方法所得结果。

1.3.4回收率比较

取0.25ml供试品分别和5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸橼酸离子对照品溶液等体积混合，加1.5%磺基水杨酸溶液0.5ml，以每分钟2000rpm的转速，离心10分钟，即得供试品溶液a、b、c；同时取0.25ml供试品，加1.5%磺基水杨酸溶液0.75ml，用两种方法分别检测，重复测定3次，计算并比较两种方法的回收率。回收率计算公式：（供试品-供试品1）*4*100%/枸橼酸离子对照品溶液理论浓度值

2.结果

2.1两种方法检测结果比较

通过配对t检验，两种方法检测同一供试品的结果没有显著性差异（P>0.05）。说明两种方法都适用于检测重组人促红素注射液中枸橼酸离子的含量。但从表1数据可看出，高效液相色谱法的检测结果中，标准差相对较小，说明高效液相色谱法与比色法相比，稳定性更好，可能原因是高效液相色谱法中样品处理操作步骤相对较少，减少了人为误差。

通过配对t检验，两种方法检测同一供试品的回收率没有显著性差异（P>0.05）。说明两种方法都适用于检测重组人促红素注射液中枸橼酸离子的含量。

3.讨论

比色法和高效液相色谱法检测重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量的检测结果是一致的，两种方法检测同一种供试品的检测结果无显著性差异，检测回收率也无显著差异，因此，理论来讲，测定重组人促红素注射液中枸橼酸离子含量可选用其中任意一种方法。但比色法检测中，用到吡啶、醋酸酐等有毒有害试剂，对环境及人身都有危害，而高效液相色谱法不存在这方面的问题，因此，从环保角度考虑，在条件允许的情况下，建议选用高效液相色谱法。

参考文献

[1]李秀莉,张卫婷.重组人促红素新注射剂及稳定性研究，《河北医药》，2009，31（2）：234-235

[2]陈爱萍,谢利群.机采血小板中枸橼酸钠中毒的原因分析,《重庆医学》，2002，31（2）：152-153

[3]王敏力,杨鹏云,侯继锋.RP-HPLC法定量测定枸橼酸离子含量,《药物分析杂志》，2011(4):788-791

[4]龚燕波，方崇波.硫酸铜比色法测定枸橼酸钾溶液的含量,《医药导报》，2006，25（06）：576-577

[5]国家药典委员会编.《中国药典》2015年版四部[S].北京化学工业出版社，通则：228