非小细胞肺癌患者胸腔积液细胞块分子病理的检测特点分析

非小细胞肺癌患者胸腔积液细胞块分子病理的检测特点分析

陈文静于大有

（黑龙江省齐齐哈尔市第一医院，黑龙江齐齐哈尔161005）

【摘要】目的：分析探讨对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的胸腔积液细胞块来代替肿瘤组织进行分子病理检测的临床意义，为临床上的诊断提供一定的参考。方法：选择分析齐齐哈尔市第一医院病理科2014年6月—2016年8月收治的40例非小细胞肺癌患者，抽取患者的胸腔积液进行分层离心获得肿瘤细胞并将之制作成细胞块进行研究分析。应用免疫组织化学检测、荧光原位杂交、基因检测等技术对细胞块进行检测分析。结果：对于细胞块切片中含有丰富的肿瘤细胞，而且组织学特征能部分保留，使用免疫组织化学染色能够帮助肿瘤的确诊及肿瘤分型的确定；对于表皮生长因子基因的荧光原位杂交的阳性检测率可以达到32.5%，其中12.5%为表皮生长因子受体基因扩增，20%为表皮生长因子受体基因高多体性扩增。基因突变的检测率25%（10例），其中7例为19外显子突变，3例为31外显子突变。

【关键词】非小细胞肺癌；胸腔积液；细胞块；分子病理

肺癌在我国是较为常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌的患者约占总肺癌患者的60%以上，但绝大部分非小细胞肺癌患者发现时便已处于中晚期，导致5年生存率极低[1]。胸腔积液是非小细胞肺癌患者的主要并发症之一。对于传统的细胞涂片检查进行常规染色也可以判断肿瘤的良恶性，但是涂片中的细胞容易成堆而且细胞涂片中的癌细胞较为分散导致阳性率极低，没有实际的临床价值[2]。对于常规的病理检测的组织通常由外科手术获得，这会给患者带来很大的伤害，对于肺癌晚期或者肿瘤转移的患者并不适用。对于非小细胞肺癌患者胸腔积液中的癌细胞进行收集制成细胞块，细胞块细胞既能使癌细胞得以聚集，又能保留肿瘤组织细胞的组织学特征，因此这种方法具有较高的诊出阳性率和准确率[2]。本文探讨了胸腔积液细胞块技术在对非小细胞肺癌的诊出的临床价值，现将研究结果报道如下：

1、资料与方法

1.1资料来源

选择分析齐齐哈尔市第一医院病理科2014年6月—2016年8月收治的40例非小细胞肺癌患者的胸腔积液样本。所有患者的年龄在31—77岁之间，平均年龄是46.2岁。所有的非小细胞肺癌患者中有男性患者22例，女性患者18例；其中腺癌为37例，鳞癌3例。

1.2方法

1.2.1细胞块的制作方法：在室温下将从非小细胞肺癌患者身上取出的胸腔积液静置10分钟到20分钟，静置以后拿出位于容器底层的50ml标本放入离心管中离心，离心机的速度调整为为每分钟2500转。离心后选择弃掉上清，向管内的沉淀物中加入10ml的10%甲醛，充分混匀，在室温下固定1个小时，之后再次离心，弃掉上清以后把沉淀物用滤纸包好，如果沉淀物比较少，可以加上75%的酒精使其凝固硬化。把硬化好的细胞块用吸管吸到显微镜擦拭纸上包好放到脱水机中进行脱水处理，脱水后进行石蜡包埋，制成细胞蜡块，将蜡块进行切片处理，切成3um和8um的两种石蜡切片[2]。

1.2.2免疫组织化学染色方法：对于3um厚的石蜡切片采用Envision法进行免疫组化染色，具体的操作流程遵守试剂盒上的要求进行。所染的指标为CKpan、WT1、CK7、TTF-1、p63等，使用的一抗都是单克隆抗体，用PBS磷酸盐缓冲液作为一抗的阴性对照。

1.2.3荧光原位杂交：对胸水样本进行表皮生长因子的荧光原位杂交。按照操作步骤，用荧光显微镜观察细胞的荧光杂交信号特征。红色信号代表的是我们想要检测的目的基因（表皮生长因子基因），绿色信号指的是对照探针。免疫荧光杂交阳性结果分为两种情况：一是Ratio≥2，出现成簇的红色细胞信号或者大于15个红色信号的细胞占总数的10%以上代表EGFR基因扩增。二是指Ratio<2但大于15个红色信号的细胞占总数的40%，指的是高多体性。Ratio<2指无扩增，阴性[3]。

1.2.4基因检测：将8um的组织块切2片放入EP管内，用试剂盒提取组织中的DNA。10ul反应体系中加入1UTapDNA聚合酶，按试剂盒上步骤进行PCR扩增后再次进行扩增至20ul体系，然后进行琼脂糖凝胶电泳判断其基因型，在紫外线下观察其扩增片段判断其基因型。检测EGFR基因的第19、20、21外显子和第一內显子的重复次数，对数据进行处理分析。

2、结果

2.1HE染色：细胞块切片中的肿瘤细胞更加丰富和集中，在显微镜下可看到肿瘤细胞的腺泡状、乳头状、梁索状等形态学特征和组织学结构。

2.2免疫组织化学染色：40例样本中的切片免疫组化结果均颗粒清楚，定位精确，切片中的癌细胞CKpan（+）、WT1、CR、D2-40（—）；反映腺癌的指标CK7、TTF-1阳性，反映鳞癌的指标p63、CK5/6阳性。

2.3荧光原位杂交：对于表皮生长因子基因的荧光原位杂交的阳性检测率可以达到32.5%（13例），其中12.5%（5例）为表皮生长因子受体基因扩增，20%（8例）为表皮生长因子受体基因高多体性扩增。

2.4基因测序：基因突变的检测率25%（10例），其中7例为19外显子突变，3例为31外显子突变。

3、讨论

细胞块切片中含有丰富的肿瘤细胞，而且组织学特征能部分保留，使用免疫组织化学染色能够帮助肿瘤的确诊及肿瘤分型的确定。对于表皮生长因子基因的荧光原位杂交的阳性检测率可以达到32.5%，基因突变的检测率25%。

使用非小细胞肺癌患者的胸腔积液细胞块来代替肿瘤组织进行分子病理的检测对非小细胞肺癌的诊出具有十分重要的临床价值，同时也可以辅助非小细胞肺癌的肿瘤分型，从而可以指导肿瘤的靶向治疗。

4、结论

使用非小细胞肺癌患者的胸腔积液细胞块来代替肿瘤组织进行分子病理的检测对非小细胞肺癌的诊出具有十分重要的临床价值，同时也可以辅助非小细胞肺癌的肿瘤分型，可以为靶向治疗肿瘤提供帮助。

参考文献：

[1]李小优，冯继锋.表皮生长因子受体基因与非小细胞肺癌的分子靶向治疗研究进展［J],医学研究生学报,2012，25(12):1311-1315．

[2]YingZhang,NanJiang,DongdongQian,XiangzhouLi,YuZhou,JiaMei,XiaohuiCao.TheChinese-GermanJournalofClinicalOncology,2014,(04):157-161.

[3]杜军，周晓军.荧光原位杂交技术在实体瘤诊断中的应用［J］．医学研究生学报，2009，22(2):213-216．

通讯作者：于大有作者单位：齐齐哈尔市第一医院

齐齐哈尔市科学技术计划项目：胸水细胞块信息检测对肺腺癌患者精准医疗的意义。

项目编号：SFZD-2015121