华桑种质资源桑叶总黄酮含量的分析

【摘要】  　　目的分析不同华桑种质资源桑叶总黄酮含量的差异，为桑叶资源的利用提供科学依据。方法采用甲醇提取，分光光度法测定。结果测定的10份华桑种质资源中，保靖4号桑叶总黄酮含量最高，为（71.67±2.96）mg/g；德江15号桑叶总黄酮含量最低，为（44.56±1.66）mg/g。结论华桑桑叶总黄酮含量较高，同属华桑的不同桑种质桑叶总黄酮含量差异极显著，但同一原生境的种质桑叶总黄酮含量相近。

【关键词】  桑叶 总黄酮含量 分光光度法

　　Abstract：ObjectiveTo obtain some basic data for the utilization of mulberry leaves (Folium Mori), the total flavonoid content of mulberry leaves from different Morus cathayana germplasm resources were determined, and the differences were analyzed. MethodsAfter extracted with methanol the total flavonoid was determined and analyzed by spectrophotometry.ResultsAmong the ten accessions of Morus cathayana germplasm resources determined, Baojing 4 had the highest content (71.67±2.96)mg/g, and Dejiang 15 had the lowest content (44.56±1.66)mg/g of total flavonoid. ConclusionThe total flavonoid content of Morus cathayana is very high. Much variation can be seen in total flavonoid content of the germplasm resources from Morus cathayana. But the content of the germplasms resources from the same habitat is similar.

　　Key words：Folium Mori；  Total flavonoid content；  Spectrophotometry

　　桑叶为桑科（Moraceae）桑属Morus L.植物的叶，中国大部分地区均有栽培生产，以南方蚕桑主产区产量最多，如江苏、浙江、安徽、四川等，现全国桑树栽植面积约80万ha。桑叶不仅是家蚕的唯一饲料，而且也是重要的传统中药，桑叶入药首见于《神农本草经》，被列为中品［1］。作为一种发散风热药，桑叶在中国及其它一些国家被广泛应用。桑叶苦、甘、寒，归肺、肝经，常用于治疗风热感冒、温病初起，肺热燥咳，喉痧、咽喉红肿、牙痛，目赤肿痛、风眼下泪，肝阳眩晕、眼目昏花，出血，自汗、盗汗，风痧等症［2］。桑叶具有降糖降脂［3，4］、抗氧化［5］、抗肿瘤等［6］多种活性。近年来对桑叶化学成分的研究表明，桑叶中含有黄酮类、生物碱类、苯丙素类、有机酸类、甾体及三萜类等多种化合物。黄酮类化合物是桑叶的重要活性成分之一。

　　中国的桑属植物有15个种4个变种［7］，其中入药者多为白桑Morus alba［1，8］。笔者通过对不同桑种桑叶总黄酮的含量的测定分析，发现华桑Morus cathayana Hemsl.，长穗桑Morus wittiorum Hand-Mazz.等野生种质资源的桑叶总黄酮含量较高，进一步选取不同原生境的10份华桑种质资源，采用分光光度法测定了桑叶总黄酮含量，为野生资源的合理利用提供科学依据。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器Thermo Spectronic Heλios α紫外可见分光光度计，索氏提取器，电热恒温水浴锅，电热恒温干燥箱，电子天平。

　　1.2  试剂石油醚（60～90℃）、甲醇均为分析纯。5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液采用分析纯试剂自配。芦丁标准品购自中国医药上海化学试剂公司。

　　1.3  材料

　　桑叶材料采自国家种质镇江桑树圃，共计10份材料，均属于华桑Morus cathayana Hensl.，经中国农业科学院蚕业研究所潘一乐研究员鉴定。

　　2  方法与结果

　　2.1  标准品溶液制备精密称取120℃常压干燥至恒重的芦丁30 mg，以少量甲醇溶解，置100 ml量瓶中，用甲醇定容至100 ml，摇匀静置，配成含芦丁0.3 mg/ml的标准溶液。

　　2.2  供试品溶液制备干燥桑叶，揉碎，称取5 g，置索氏提取器中，加甲醇100 ml，于恒温水浴锅上90℃ 提取3 h，过滤定容于100 ml量瓶中，得供试品溶液。

　　2.3  测定液制备取供试液1 ml，置于25 ml量瓶中，加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液1 ml，混匀，放置6 min；加1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml，以甲醇定容至25 ml，混匀，放置15 min，得测定液。

　　2.4   标准曲线绘制精密量取标准品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，按“2.3”项的方法制成测定液。以不加标准溶液的相应溶液为空白，在波长505 nm处测定吸光度值，得到标准液浓度（Y）与吸光度（X）之间的回归方程。

　　2.5  测定波长选择取标准溶液和供试液各1 ml，分别置于25 ml量瓶中，按“2.3”项的方法平行制备标准溶液及供试液的测定液。以不加标准溶液或供试液的相应溶液为空白，在200～800 nm波长范围内进行不断缩小范围的反复连续波长扫瞄，结果表明标准液及供试液均在505 nm有最大吸收，并且不受桑叶中色素等脂溶性成分的影响，故选择505 nm为测定波长。

　　2.6  提取溶剂及提取方法选择分别以乙醇、甲醇为提取溶剂，又分别用石油醚脱脂、不脱脂，进行了提取溶剂及提取方法的选择。结果表明，先用石油醚脱脂，再用溶剂提取，并不能提高桑叶总黄酮的得率；分别用乙醇和甲醇作提取溶剂，总黄酮的提取效率相当。因此，拟以甲醇提取，用硝酸铝显色法，在505 nm测定桑叶总黄酮的含量。2.7  重复性实验称取5份干燥桑叶样品，分别按“2.2”及“2.3”项下的方法制成5份供试液及硝酸铝显色测定液，以不加供试液的相应溶液为空白，在波长505 nm处测定吸光度值，并计算总黄酮含量及RSD值。结果见表1。表1  重复性实验结果（略）

　　2.8  稳定性实验称取干燥桑叶5 g，按“2.2”及“2.3”项下的方法制成供试液和测定液，首次测定后，每隔10 min测定1次，记录吸光度值，考察其显色后的稳定性。结果见表2。表2  稳定性实验结果Ⅰ（略０

    为了考察供试液的稳定性，分别于提取1 d及5 d后，将提取液（供试液）中加入显色剂，测定其吸光度值。结果如表3。表3  稳定性实验结果Ⅱ（略）

　　说明提取液不加入显色剂时稳定较好，而加入显色剂后稳定性较差，须在30 min内尽快测定为宜。

　　2.9  精密度实验称取干燥桑叶5 g，按“2.2”及“2.3”项下的方法制备5份测定液，测定吸光度值，并计算总黄酮含量及RSD值。结果见表4。表4  精密度实验结果（略）

　　2.10  回收率实验取精密度实验的供试液各1 ml，分别置于5只25 ml量瓶中，分别加入标准液1 ml，再按“2.3”项的方法制成测定液，测定吸光度值，计算测定液总黄酮浓度、回收率及RSD，结果见表5。
   
　　以上重复性实验、精密度实验、回收率实验表明，以甲醇提取、硝酸铝显色、505 nm测定的分光光度法适用于桑叶总黄酮含量的测定，该方法操作简便、结果可靠、重现性好。而稳定性实验表明，提取液稳定性较好，但加入硝酸铝显色后稳定性较差，宜在30 min内尽早测定。表5  回收率实验结果（略）

　　2.11  华桑种质资源桑叶样品测定

　　2.11.1  标准品溶液制备及标准曲线绘制 按上述标准液制备及标准曲线绘制方法，精密称取120℃常压干燥至恒重的芦丁60 mg，配成含芦丁0.6 mg/ml的标准溶液。得到标准液浓度（Y）与吸光度（X）之间的回归方程为：Y = 0.101 07X + 0.000 69，r= 0.999 9，该回归方程在0 ～ 72 mg/g范围内呈现良好的线性关系。

　　2.11.2  华桑种质资源桑叶总黄酮含量差异 按照上述供试液及测定液制备方法，10份华桑种质资源桑叶样品均平行制备3份测定液样品，以不加供试液的相应溶液为空白，在波长505 nm处测定吸光度值，按回归方程计算测定浓度，然后按下式计算样品中总黄酮的含量（C）：C（mg/g）= (Y × 25×100) / 5 = 500Y。结果见表6。表6  华桑种质资源桑叶总黄酮含量及多重比较(略)

　　上标字母相同表示SSR法多重比较差异不显著；*α=0.01

　　测定结果表明，华桑种质资源桑叶总黄酮含量总体较高，平均达到55.38 mg/g。不同华桑种质资源桑叶总黄酮含量相差较大，含量最高的保靖4号达（71.67±2.96）mg/g，含量最低的德江15号为（44.56±1.66）mg/g。为进一步明确不同种质资源总黄酮含量差异显著性，进行了方差分析和多重比较，除保靖4号含量特别高以外，其余种质总黄酮含量差异都不悬殊。从这些种质的原产地来看，同一原产地的种质桑叶总黄酮含量相近。原产于湖南的保靖4号及保靖8号含量最高，原产于四川的雅安3号、雅安9号含量相近，原产于安徽的皮桑及皖皮桑2号含量相仿，原产于贵州的德江岩桑、道真岩桑及德江15号含量也近似。

　　3  讨论

　　通过甲醇提取、硝酸铝显色、分光光度法测定，分析了华桑种质资源桑叶总黄酮含量。该方法操作简便、结果可靠、重复性好，适宜于桑叶总黄酮含量测定。实验结果表明，华桑桑叶总黄酮含量较高，同属华桑的不同种质资源总黄酮含量有显著差异，其中原产于湖南的保靖4号桑叶总黄酮含量最高。

　　《中国药典》Ⅰ部（2000年版）记载：桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶［8］；《现代中药学大辞典》记载的桑也是指的Morus alba L. ［1］。在对不同桑种桑叶总黄酮含量初步分析的基础上，对含量较高的华桑进行了进一步的分析测定，确证了华桑黄酮含量较高，提示在桑叶药源的拓展上，应该重视华桑等野生种的利用和开发。进一步分析这些华桑种质资源发现，原生境相同的种质资源，桑叶总黄酮含量相近。

【参考文献】
  　　［1］宋立人，洪 恂，丁绪亮，等. 现代中药学大辞典［M］.北京：人民卫生出版社，2001：1821.

　　［2］高学敏. 中药学［M］.北京：人民卫生出版社，2000：309.

　　［3］Andallu B, Suryakantham V, Lakshmi Srikanthi B, et al. Effect of mulberry (Morus indica L.) therapy on plasma and erythrocyte membrane lipids in patients with type 2 diabetes［J］.Clin Chim Acta, 2001, 314(1～2)：47.

　　［4］Andallu B, Varadacharyulu NCh. Control of hyperglycemia and retardation of cataract by mulberry (Morus indica L.) leaves in streptozotocin diabetic rats (J)［J］. Indian J Exp Biol, 2002, 40(7)：791.

　　［5］Doi K, Kojima T, Fujimoto Y. Mulberry leaf extract inhibits the oxidative modification of rabbit and human low density lipoprotein (J)［J］. Biol Pharm Bull, 2000, 23(9): 1066.

　　［6］Kim SY, Gao JJ, Kang HK. Two flavonoids from the leaves of Morus alba induce differentiation of the human promyelocytic leukemia (HL-60) cell line［J］. Biol Pharm Bull, 2000, 23(4)：451.

　　［7］中国农业科学院蚕业研究所. 中国桑树品种志［M］.北京：农业出版社，1993：5.

　　［8］国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2002：244.