简介:摘要目的建立可用于确诊先天性维生素K依赖性凝血因子缺乏症1(vitamin K-dependent coagulation factor deficiency 1,VKCFD1)疾病的细胞体系。方法在稳定表达报告基因FIX-Gla-PC的HEK293细胞中,应用CRISPR/Cas9技术敲除GGCX基因;通过ELISA、DNA测序、Western印迹等方法鉴定GGCX基因敲除的单克隆细胞。用快速点变异的方法构建致病性GGCX变异体质粒;用ELISA方法检测GGCX变异对报告基因的影响。结果首先用ELISA方法筛选到两株报告基因无活性的单克隆细胞;之后DNA测序结果和Western印迹验证GGCX基因发生了编辑和敲除;最后通过转染野生型GGCX基因,可以恢复报告基因的活性,提示成功筛选到两株GGCX基因敲除的单克隆细胞。在筛选到的细胞株中转染已知可导致VKCFD1的GGCX变异体,发现报告基因活性在致病性变异体中显著降低。结论成功构建了检测GGCX活性的细胞体系,该体系可以用于诊断GGCX变异导致的VKCFD1。
简介:目的构建含趋化因子融合蛋白SDF-KDEL的慢病毒载体pLenti6/V5-S-K,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段SDF-KDEL,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D—TOPO载体,构建慢病毒载体pLenti6/V5-S—K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染人宫颈癌HeLa细胞观察SDF-1蛋白的表达。结果成功构建了慢病毒载体pLenti6/V5-S—K,并证实SDF-1蛋白可在HeLa细胞系内表达。结论慢病毒载体可介导CXC-细胞内趋化因子(CX&in-trakine,SDF-K)基因高效、稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗。
简介:寝室里的小强最近迷上了“超级女声”,每天苦练K歌,不过他不是到KTV歌城去,而是在寝室里接上耳麦,对着他的电脑干嚎……于是晚饭后小强K歌时,寝室众弟兄就抱头鼠窜。