简介:BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.
简介:以pErl30a为载体构建的表达拟南芥热激因子AtHsfAla的大肠杆菌EcoliM15(pET30a/His6一AtHsfAla)为实验材料,以IPTG诱导6XHis融合蛋白的表达并经过Ni2+柱分离纯化AtHsfAla,再通过SDS—PAGE鉴定表达蛋白和纯化蛋白.结果显示,AtHsfAla蛋白在在PET原核表达系统中能够有效表达,并能通过亲和层析获得纯化的AtHsfAla蛋白.研究结果为揭示拟南芥热激因子AtHsfAla的作用机理奠定基础.
简介:教学过程关键在于设计好“教学主线”,并最终把教师和教材的知识及其结构变成学生的知识及其结构。文章指出了知识系统逻辑/学生理解逻辑与教师讲授逻辑的区别。教学过程一般来说是一种知识传递的教学线性化过程,讨论了知识讲授的教学过程线性化及其对知识的系统结构的还原问题。为此给出一种基于系统科学知识模型(SSBKM)的知识结构组织方法;重点提出了“基于系统科学知识模型的教学主线的设计方法”,认为,只有以某种教学主线组织教学,做教学过程的线性化并能还原知识的本源结构,才能真正谈到对所学知识的掌握。文中还提到促进教学主线的教学方法:“思(考),(浏)览,(攻)读,学(习),练(习)与(运)用”之多重循环的教学方法。文章还以本文为例作为“一项知识”——Y,例说了Y的基于系统科学的教学表达法。
简介:目的:构建可诱导表达野生型或突变型第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的慢病毒表达体系.为进一步研究PTEN与肿瘤间的关系提供理想的实验工具。方法:提取甲状腺癌、肺癌及其癌旁组织的RNA,经反转录后扩增PTEN片段,将其连接入慢病毒载体,与病毒包装质粒共转染人胚肾T细胞(293T)细胞,获得病毒。将其感染MDA-MB-231细胞.用嘌呤霉素筛选,获得稳定表达的细胞株。采用蛋白印迹法检测稳定转染的细胞株中PTEN基因的表达情况,用软琼脂克隆形成实验检测细胞株的克隆形成能力。结果:在甲状腺癌和肺癌中发现PTEN突变体:蛋白印迹检测结果证实野生型和突变型PTEN的慢病毒表达体系构建成功.突变型PTEN的克隆形成能力强于野生型PTEN。结论:发现了PTEN突变体.并成功构建了野生型和突变型PTEN基因的可诱导慢病毒表达体系,突变型PTEN不但有抑癌作用.还有致癌作用。