简介：目的：选择α-MSH作为重组毒素的导向部分，来自人类本身的血管生成素基因Ang作为毒性部分，合成具有高度特异性的重组毒素。方法：用PCR方法将MSH基因和Ang基因通过柔性Linker（Gly4Ser）2，连接成为一个基因，并定向克隆到原核表达载体pET20b中，构建了重组毒素的表达质粒。结果：MSH基因和Ang基因可以合成重组质粒pET／MSH-Ang。结论：通过酶切鉴定和核酸序列测定证明了重组毒素表达质粒构建的正确性。

简介：随着加速康复外科(enhancedrecoveryaftersurgery,ERAS)理念的提出及实践,其有效性和安全性已得到证实。目前ERAS临床实践多强调围术期处理,评估指标多关注术后住院日、首次肛门排气排便时间等。这些指标尽管相对较客观,但忽略了患者的自身感受,未能全面客观地评价ERAS的临床实践效果。患者报告的临床结局(patientreportedoutcomes,PROs)为近年兴起的评价体系,有研究证实其与ERAS有潜在联系。本文就消化肿瘤ERAS临床评价体系进行探讨。

简介：目的构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatincDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatincDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。

简介：目的构建以rAAV为载体、GFP为报告基因和HIF-1α为靶基因的RNA干扰。方法提取人基因组DNA，PCR扩增人H1启动子，插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方MluⅠ单克隆位点，构建成pH1—hrGFP；根据HIF-1α的有效干扰位点，合成两条分别为58bp互补的寡核苷酸链，通过体外退火形成双链，然后插入pH1-hrGFP的H1启动子尾部XbaⅠ和MunⅠ位点，构建成pH1—siRNA；将载体质粒pH1-siRNA和辅助质粒pRC、pHelper共转染HEK293细胞，反复冻溶后收集上清，浓缩纯化，电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。结果构建的pH1-hrGFP质粒，通过酶切、PCR检测以及测序鉴定均正确；构建的pH1—siRNA，通过酶切及测序鉴定也正确；包装的rAAV经电镜检测形态正常，滴度达1．2×10^12v．p／mL。结论成功构建了rAAV介导的HIF-1α—RNAi表达载体，为今后的体内外试验奠定了基础。

简介：目的构建ITIH4基因重组慢病毒干扰系统。方法选取干扰效果最佳的siRNA片段，设计shRNA结构，退火反应形成双链后采用T4DNA连结酶与线性化慢病毒载体Psico连接，转化大肠杆菌后提取质粒，并经质粒DNA测序和PCR鉴定重组质粒构建是否成功，转染293T细胞并测定培养上液的病毒滴度。结果测序结果显示，重组慢病毒干扰载体Psico／ITIH4测序结果与设计的shRNA序列完全一致，转染293T细胞后，其病毒滴度为9．5×10^3IU／mL。结论成功地构建了ITIH4基因的重组慢病毒系统，为今后深入研究ITIH4奠定了基础。

简介：目的使用旋转细胞培养系统（rotatingcellculturesystem，RCCS）模拟微重力环境，建立胰腺癌神经转移的体外模型。方法将裸鼠背根神经节（dorsalrootganglion，DRG）和人胰腺癌细胞株MIAPaCa-2置于RCCS系统中混合培养，在额定时间点取神经组织送病理，Gomori染色观察神经组织结构和胰腺癌细胞在神经组织块中生长情况。结果DRG培养12h后，镜下可见有一神经突起自DRG周缘长出；72h后，可见神经突起显著延长、增多，多数突起结构有一分支，大体呈放射状排列。MIAPaCa-2细胞能够溶解基质。癌细胞与DRG共培养48h，可见有癌细胞靠近神经纤维并贴附其生长。72h可见癌细胞形成包绕神经纤维的细胞团，典型的表现为形成以神经纤维为中轴的纺锤样结构。结论使用RCCS系统模拟微重力环境，构建胰腺癌神经转移体外模型，可以用于胰腺癌神经转移过程和机制的研究，为研究胰腺癌细胞和神经组织间的相互关系提供新的方法。

简介：背景与目的:研究发现,miR-7对胶质瘤细胞的增殖分化有重要影响,本实验构建mir-7-3基因慢病毒表达载体,为进一步研究mir-7-3基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用提供基础。方法:采用PCR技术从含有mir-7-3基因的质粒pENTR-MIRNAVECTOR扩增目的基因mir-7-3,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-RNAiVECTOR[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒Lenti-GFP-mir-7-3,酶切、测序验证mir-7-3基因后,将Lenti-GFP-mir-7-3质粒和包装质粒pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带mir-7-3基因和EGFP基因的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达。结果:CLenti-GFP-mir-7-3共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒FIV-CMV-EGFP-mir-7-3,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,FIV-CMV-EGFP-mir-7-3中携带有正确的mir-7-3基因,。结论:成功构建了携带mir-7-3基因的重组慢病毒载体;为进一步从分子水平探讨mir-7-3基因治疗胶质瘤奠定了基础。

简介：消化肿瘤是最常见的肿瘤死亡原因.最近的资料显示,每年全球共有一千零八十万人罹患肿瘤,其中大约三百三十万是消化肿瘤,包括食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和胰腺癌等.

简介：目的：构建并制备能够有效表达EB病毒BHRF1基因的重组慢病毒载体,观察BHRF1表达对人胚肺成纤维细胞（KMB17）凋亡的影响。方法：采用RT-PCR法,从B95-8细胞扩增EBVBHRF1基因,克隆至pWPIGW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒。将纯化后的重组慢病毒直接感染293T和KMB17细胞,荧光显微镜、实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法检测BHRF1在细胞中的表达水平。流式细胞仪检测BHRF1表达对凋亡诱导剂或无血清培养诱发KMB17细胞凋亡的影响。结果：重组慢病毒介导BHRF1在293T和KMB17细胞内获得表达,能有效地抑制KMB17细胞的凋亡。结论：成功构建了表达BHRF1基因的重组慢病毒载体。

简介：慢病毒载体（lentivirusvector,LV）是作为目前研究最多的外源性转基因载体之一,在基因转染方面有着许多独特的优势,例如,对细胞是否处于有丝分裂期没有特别的要求,基因转染效率高,可容纳较大基因片段等。本文就慢病毒载体系统的概述、肿瘤的基因治疗、转基因动物模型构建等方面进行综述。

简介：目的：构建白细胞介素7（IL-7）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法：将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果：pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论：pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。

简介：目的构建结直肠癌患者来源的异种移植（PDX）模型,探讨中药＂消癥方＂对结直肠癌PDX模型的抑瘤作用。方法收集2016年12月至2017年2月5例结直肠癌组织标本构建PDX模型,传代培养。选择1例患者来源的肿瘤构建P3代模型,将10只P3代小鼠随机分为对照组和消癥方组,每组5只。对照组小鼠给予饮用水,消癥方组给予中药汤剂,均自由饮用,持续24天。观察两组小鼠的生存状态,测量体质量、瘤体积和瘤质量,计算抑瘤率。结果5例结直肠癌组织标本,P1代建模成功4例,P2代建模成功3例。PDX模型基本保留了患者来源肿瘤的组织学特征。10只P3代荷瘤鼠在给药过程中未出现死亡,摄食量正常,饮水（药）量正常,无明显不良反应。实验结束时,消癥方组小鼠肿瘤体积均值略小于对照组,瘤质量略大于对照组,差异均无统计学意义（P〉0.05）。消癥方组的抑瘤率为-4.8%。结论结直肠癌PDX模型建模及给药技术基本成熟,但中药消癥方在实验中未显示抑瘤作用。

简介：骨骼系统肿瘤分为原发性和继发性两种，骨肉瘤是原发恶性骨肿瘤之一。乳腺癌、前列腺癌、肺癌等均具有较强的骨转移倾向。通过向动物骨髓腔内接种肿瘤细胞建立的肿瘤模型，具有成瘤周期短、操作简单、重复性好、成功率高等优点，为原发性骨肿瘤和肿瘤骨转移发病机制的研究提供了重要工具。本文对胫骨内注射肿瘤细胞法构建骨肿瘤动物模型的研究进展进行综述。

简介：目的构建Sprouty2低表达肾癌细胞株，以进一步研究Sprouty2蛋白在肾癌发病机制中的生物学功能。方法采用RNAi技术，构建3组质粒，分别转染肾癌细胞系786-0，建立Sprouty2低表达肾癌细胞株，并运用Westernblot检测细胞Sprouty2的表达。结果成功构建Sprouty2siRNA质粒，转染肾癌细胞后转染组可见绿色荧光蛋白表达，Westernblot检测显示Sprouty2表达降低。结论运用RNAi技术可成功诱导786-0细胞系中Sprouty2蛋白表达降低，为进一步研究蛋白功能提供实验基础。

简介：目的检测卵巢癌细胞株中TIZ基因的mRNA表达水平，并构建TIZ基因的特异性RNA干扰（RNAi）载体。方法通过RT-PCR方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、SKOV3顺铂耐药细胞、SKOV3卡铂耐药细胞、A2780、A2780卡铂耐药细胞、H08910）中TIZmRNA的表达；根据Genebank上TIZ的mRNA序列，设计5对siRNA干扰片段，采用脂质体转染法介导siRNA干扰片段并下调卵巢癌细胞系中TIZmRNA的表达。采用pTG19-T质粒构建TIZ和β-actintmRNA表达重组质粒并制备其标准品。采用实时定量PCR（QRT—PCR）检测siRNA干扰片段对TIZ基因的下降效率，并筛选最佳siRNA干扰片段。以pGPU6／GFP／Neo载体和质粒DNA测序方法构建pGPU6／GFP／Neo-siRNA—TIZ-573重组质粒。结果①除卵巢癌细胞H08910细胞无TIZ基因mRNA表达外，其余细胞均有TIZ基因mRNA表达。②细胞siRNA干扰片段筛选结果显示介导TIZ-573片段后可下调60％细胞TIZmRNA表达。③成功构建了TIZ基因RNAi载体pG-PU6／GFP／Neo-TIZ-573。结论多数卵巢癌细胞系表达TIZmRNA。siRNA-TIZ-573为最佳下调细胞TIZmRNA片段。构建的pGPU6／GFP／Neo-TIZ-573重组质粒可用于下一步的实验研究。

简介：目的构建能表达抗人膀胱癌重链可变区免疫毒素的重组质粒并进行表达。方法应用基因工程方法，将抗人膀胱癌的单克隆抗体重链可变区基因与绿脓杆菌外毒素基因进行重组，得到的质粒转化大肠杆菌JM109，鉴定后的阳性克隆经IPTG锈导表达。结果重组质粒经酶切鉴定正确，IPTG诱导后可看到明显的表达带，分子大小与预计值相符。结论得到了能表达抗人膀胱癌重链可变区免疫毒素的重组质粒。

简介：目的：构建3＊Flag-hSesn1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位。方法：以GSThSesn1为模板,利用聚合酶链反应扩增hSesn1基因cDNA全长,并将其克隆至3＊Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组载体进行双酶切和测序鉴定,并转染到MG-63骨肉瘤细胞中,提取总蛋白进行Westernblot检测。进一步利用共聚焦激光显微镜观察3＊Flag-hSesn1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化人源Sesn1蛋白。结果：hSesn1基因的cDNA全长成功构建到3＊Flag标签的真核表达载体中,Westernblot检测到了含有Flag标签的人源Sesn1融合蛋白表达,且在MG-63骨肉瘤细胞中主要定位于细胞质和核周,并成功纯化人源Sesn1蛋白。结论：成功构建了3＊Flag-hSesn1真核表达质粒,同时鉴定了其融合蛋白的表达,并纯化人源Sesn1蛋白。3＊Flag-hSesn1蛋白主要定位在细胞质,部分定位于细胞核周。

简介：目的构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc（SLC-HP-Fc）的重组腺病毒AdEasy^TM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMVSLC-HP-Fc,经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coliBJ5183中进行同源重组,得到重组腺病毒真核表达载体AdEasy^TM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine2000转染293细胞,通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasy^TM-SLC-HP-Fc,成功转染293细胞出现细胞病变反应,经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体,并建立了重组腺病毒AdEasy^TM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库,为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。

简介：目的构建稳定过表达X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（X-linkedinhibitorofapoptosisassociatedfactor1,XAF1）基因的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。方法分别将携带XAF1基因感染复数（multiplicityofinfection,MOI）为50的慢病毒稀释液。MOI为100的慢病毒原液和MOI为100的慢病毒原液加入终浓度为5μg/mL的聚凝胺（polybrene）转染人鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。通过倒置荧光显微镜观察细胞内荧光数量及强度评判转染效率,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-timequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qRT-PCR）和蛋白免疫印记法（westernblot）检测XAF1基因mRNA和蛋白的表达。结果慢病毒稀释液转染,约60%的细胞可观察到微弱荧光;慢病毒原液转染,约70%的细胞观察到较弱荧光;慢病毒原液加入5μg/mLpolybrene的转染效率较高,约90%的细胞观察到较强荧光。嘌呤霉素筛选上述转染效率最高的慢病毒原液加5μg/mLpolybrene组细胞,其成功将携带XAF1基因的慢病毒转入鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。qRT-PCR和westernblot进一步证实细胞株稳定过表达XAF1基因。结论慢病毒加polybrene转染可成功构建稳定过表达XAF1基因的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R细胞株。

简介：目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库，以阳性克隆为模板，RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础，经过多次酶切连接，构建逆病毒表达载体pMX—MTA1-flag—IRES—EGFP。将构建好的逆病毒载体系统，转染293-gag／pol细胞，包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞，获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿，获得大量单克隆细胞系，以GFP为筛选标志，筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、WesternBlot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关，相关系数r=0．932，P〈0．01。结论利用逆病毒表达系统，快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系，为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。