简介：摘要目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对骨肉瘤细胞顺铂耐药性的影响及其机制，为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路。方法体外培养MG-63细胞，予2 μg/mL顺铂重复给药建立MG-63耐药细胞株，向MG-63耐药细胞株中转染miRNA-22高表达质粒建立miRNA-22高表达的MG-63耐药细胞株。以MG-63细胞为对照组，MG-63耐药细胞为耐药组，用2 μg/mL顺铂处理后的MG-63耐药细胞和转染miRNA-22的MG-63耐药细胞分别为耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组。采用噻唑兰(MTT)法检测细胞增殖能力。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内PI3K、AKT以及mTOR mRNA的表达。采用Western blot检测细胞内PI3K、AKT以及mTOR蛋白的表达。结果(1)MTT法检测结果显示，对照组、耐药组、耐药DDP组和耐药miRNA-22＋DDP组的吸光度分别为1.097±0.039、1.157±0.065、0.870±0.014和0.737±0.029，差异有统计学意义(F＝67.731，P<0.01)：与对照组比较，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组吸光度均明显下降，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；耐药组、耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组3组间比较，吸光度呈下降趋势，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。(2)荧光定量RT-PCR结果显示，与对照组比较，耐药组、耐药DDP组PI3K、AKT的相对表达量均增多，尤其以耐药组增多明显(P值均<0.01)，耐药miRNA-22＋DDP组与对照组差异均无统计学意义(P值均>0.01)；而mTOR相对表达量耐药组增高，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组均降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR的相对表达量均低于耐药组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；而耐药miRNA-22＋DDP组仅PI3K、mTOR的相对表达量低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。(3)Western blot检测结果显示，与对照组比较，耐药组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显增加，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。耐药组、耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组3组间两两比较，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显低于耐药组，耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论PI3K-AKT-mTOR通路参与了骨肉瘤细胞对顺铂耐药性的产生，miRNA-22通过下调PI3K-AKT-mTOR通路中PI3K、AKT以及mTOR的表达降低骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。

简介：摘要目的研究磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路介导的血管内皮细胞(VEC)自噬及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白短发卡RNA(mTOR-shRNA)靶向调控在激素性股骨头坏死中作用。方法2019年3月至7月，从SD大鼠股骨头中分离培养血管内皮细胞分为3组，即空白对照组(Ctrl)，甲基强的松龙组(MP)及甲基强的松龙联合mTOR-shRNA腺病毒转染组(MP+shmTOR)。分别对各组自噬体、血管内皮细胞损伤情况进行观察，并对各组自噬相关基因以及PI3K/Akt/mTOR的mRNA和蛋白表达进行测定；多组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数两两比较采用LSD检验。结果甲基强的松龙抑制了VEC中自噬关键基因的表达，但诱导mTOR、PI3K、Akt基因高表达。MP组中PI3K、Akt、mTOR的mRNA与蛋白表达明显高于Ctrl组，MP+shmTOR组介于两组之间；而Beclin1、MAP1 LC3的mRNA与蛋白表达明显低于Ctrl组，MP+shmTOR组介于两组之间(平均灰度值3 837.9比2 996.3比3 005.6，F＝428.640，P<0.01)；甲基强的松龙经PI3K/Akt/mTOR对VEC的自噬进行抑制，mTOR-shRNA转染可以部分修复甲基强的松龙导致的VEC损伤。Ctrl组中6-keto-PGF1α的含量稳定，在4个检测点含量无改变；MP组6-keto-PGF1α的含量在4个检测点逐渐增加；MP+shmTOR组6-keto-PGF1α的含量在4个检测点均高于Ctrl组，低于MP组(平均吸光光度值104.98比206.83比145.91，F＝352.830，P<0.01)。结论甲基强的松龙诱导的VEC损伤为PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬异常，mTOR-shRNA可部分阻断该病理过程从而促进VEC修复。