简介：摘要目的构建并拯救增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标记的EGFP-EV-A71重组病毒。方法利用重叠PCR技术，以pMD19T-SDLY107全长质粒为模板，将2A蛋白酶识别序列加入到结构蛋白VP4的5′端；以pEGFP-N1质粒作为模板，扩增获得EGFP目的片段，将其插入到上述重组质粒中，得到重组质粒pMD19T-107-EGFP。经酶切和体外转录后，转染横纹肌细胞肉瘤(RD)，拯救获得重组病毒EGFP-EV-A71。采用Karber法计算细胞培养半数感染量(CCID50)以测定病毒滴度。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同时间点的病毒复制水平，并绘制病毒复制曲线，比较重组病毒与母本病毒的复制力有无差异。乳酸脱氢酶(LDH)和细胞增殖(CCK-8)实验分别测定被感染细胞的细胞损伤率和存活率。结果包含EGFP的重组EV-A71感染性cDNA克隆被成功构建；转染RD细胞后，出现典型的细胞病变并且表达出较强的绿色荧光；重组病毒与母本病毒具有相似的复制动力学特征和致细胞病变效应。结论成功拯救了EGFP标记的重组病毒EGFP-EV-A71。

简介：摘要目的对2017年山东省临沂市手足口病(hand, foot and mouth disease，HFMD)患儿粪便标本进行病毒分离与鉴定，并对其基因特征进行分析。方法对HFMD患儿粪便标本进行核酸检测。用人横纹肌肉瘤细胞进行病毒分离。对病毒进行全基因组序列测定，通过与人类肠道病毒比较，对分离株进行系统发育分析和基因重组分析。结果自重症HFMD患儿粪便标本中成功分离到1株柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A group 2 type, CoV－A2)，命名为CoV-A2 SD17-430，系统进化分析进一步确定其基因型属于D2基因型。SD17-430衣壳蛋白编码区与CoV-A2国际原始株同源性高，在非结构蛋白编码区与CoV-A4(MH086949)和CoV-A14(KP036482)同源性高。结论与原始毒株相比，CoV-A2 SD17-430株发生了较大程度的遗传变异，其进化过程中可能与多个A组肠道病毒发生了基因重组。应继续加强对HFMD病原的全面监测，以便进一步了解其病原谱变化，为制定更有效的HFMD防控策略提供数据参考。

简介：摘要目的研究肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中3D蛋白关键氨基酸突变对病毒增殖的影响，并根据3D三级结构模型推断突变影响病毒增殖能力的可能机制。方法以强毒株SDLY107构建的质粒pMD19T-SDLY107-EGFP为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建病毒突变株，对突变株增殖特性进行测定。同时对3D蛋白三级结构进行预测，根据3D蛋白的结构域功能特性推测突变影响病毒增殖能力的可能机制。结果经过双酶切鉴定和病毒基因测序证实已成功构建两株突变株病毒：EGFP-EV-A71(S37N)和EGFP-EV-A71(R142K)。两株突变株在RD细胞中的增殖速率均明显弱于亲本毒株。3D蛋白三级结构预测模型显示3D蛋白由"手指(finger)"、"拇指(thumb)"和"手掌(palm)"三个结构域构成握杯状右手结构，S37N位于"拇指"结构域，R142K位于"手指"结构域，而"拇指"和"手指"结构域对3D聚合酶的活性以及蛋白的稳定性具有重要影响。结论S37N和R142K突变降低了EV71的复制能力，这两个突变可能是通过改变3D蛋白聚合酶活性和结构域之间的相互作用，进而影响EV71病毒增殖。