简介：摘要目的观察白细胞介素6（IL-6）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表型和功能的影响，探索IL-6在内皮-间充质转化（EndMT）过程中的作用。方法采用实验研究方法。取产妇行分娩手术后弃用的新鲜正常胎儿脐带，分离培养原代细胞的第2天在倒置相差显微镜下观察细胞形态；免疫荧光法鉴定第4代细胞是否为HUVEC后，取2批第3～5代HUVEC，用于后续实验。将第1批细胞按随机数字表法（下同）分为6组：空白对照组、5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组，将第2批细胞分为4组：空白对照组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组；空白对照组仅加入完全培养液，其余各组细胞还加入相应终质量浓度的IL-6。第1批细胞，分组培养后72 h，倒置相差显微镜下观察6组HUVEC形态；免疫荧光法检测6组HUVEC凝血因子Ⅷ和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的阳性表达，并计算双阳性细胞数占凝血因子Ⅷ阳性细胞数的比值（以下简称双阳性细胞数的比值），样本数为6；实时荧光定量反转录PCR法检测6组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白和α-SMA蛋白的mRNA表达量，样本数为3。第2批细胞，分组培养后72 h，蛋白质印迹法检测4组HUVEC 血管内皮钙黏蛋白、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达量，样本数为3。对数据行单因素方差分析、Bonferroni校正。结果原代分离培养的第2天细胞呈短梭形或多边形，免疫荧光法鉴定第4代细胞为HUVEC。第1批细胞，分组培养后72 h，6组细胞随IL-6浓度的逐渐增加，其形态向长梭形变化，细胞间连接减少或消失、间隙变大。分组培养后72 h，与空白对照组双阳性细胞数的比值相比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组显著增高（P<0.01）；与5 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高（P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值相比，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组显著升高（P<0.01）；100 ng/mL IL-6组双阳性细胞数的比值均显著高于25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组（P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（P<0.05或P<0.01）；与5 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组均明显下降（P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的mRNA表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（P<0.01）；与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白mRNA的表达量比较，50 ng/mL IL-6组和100 ng/mL IL-6组明显下降（P<0.01）。分组培养后72 h，5 ng/mL IL-6组、10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组、100 ng/mL IL-6组细胞 α-SMA的 mRNA表达水平显著高于空白对照组（P<0.05或P<0.01）。第2批细胞分组培养后72 h，与空白对照组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量1.391±0.026比较，10 ng/mL IL-6组（1.185±0.063）、25 ng/mL IL-6组（0.717±0.078）、50 ng/mL IL-6组（0.293±0.064）显著降低（P<0.05）；与10 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著降低（P<0.01）；与25 ng/mL IL-6组细胞血管内皮钙黏蛋白的蛋白表达量比较，50 ng/mL IL-6组显著降低（P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞α-SMA的蛋白表达量比较，10 ng/mL IL-6组、25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著升高（P<0.01）；与10 ng/mL IL-6组细胞α-SMA的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加（P<0.01）。分组培养后72 h，与空白对照组细胞Ⅰ型胶原的蛋白表达量比较，25 ng/mL IL-6组、50 ng/mL IL-6组显著增加（P<0.05）。结论IL-6作用于HUVEC后，细胞的表型和功能呈浓度依赖性表现为间质细胞的特征。炎症因子可促进EndMT进程，成为调控组织纤维化机制的重要因子之一。

简介：摘要目的研究严重创伤患者细胞免疫功能动态变化规律及其在创伤预后评估中的作用。方法采用前瞻性队列研究设计，连续纳入重庆市急救医疗中心2019年11月至2020年1月收治的创伤患者为研究对象。采集患者伤后1、3、5、7、14 d外周血，分离白细胞，采用流式细胞分析技术检测中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞表面CD64、CD274、CD279表达及CD3+总T淋巴细胞、CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群。根据损伤严重度评分（ISS）和伤后28 d内是否发生脓毒症分组，分析患者细胞免疫指标的动态变化及与创伤严重程度、感染并发症的关系；进一步采用Pearson检验分析细胞免疫指标与急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ（APACHEⅡ）、序贯器官衰竭评分（SOFA）、ISS评分的相关性。结果共纳入42例创伤患者，其中ISS>25分的严重伤患者8例，16分<ISS≤25分的重伤患者及ISS≤16分的轻伤患者各17例；伤后28 d内发生脓毒症6例，脓毒症发病率为14.3%。在创伤发生后不同时间点比较各细胞免疫指标动态变化显示，CD64指数和CD4+ T淋巴细胞亚群比例随时间延长逐渐增加（H＝15.464、P＝0.004，F＝2.491、P＝0.035）。伤后1 d和3 d，损伤越重的患者，其CD64指数及中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞CD279阳性率越高。伤后1 d轻伤、重伤、严重伤患者的CD64指数分别为2.81±1.79、1.77±0.92、3.49±1.09，中性粒细胞CD279阳性率分别为1.40%（0.32%，2.04%）、0.95%（0.44%，2.70%）、12.73%（3.00%，25.20%），淋巴细胞CD279阳性率分别为3.77%（3.04%，5.15%）、4.71%（4.08%，6.32%）、8.01%（4.59%，11.59%），单核细胞CD279阳性率分别为0.57%（0.24%，1.09%）、0.85%（0.22%，1.25%）、6.74%（2.61%，18.94%），其中严重伤患者CD64指数显著高于重伤患者，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的CD279阳性率显著高于轻伤和重伤患者（均P<0.05）。伤后3 d，严重伤患者CD64指数和淋巴细胞CD279阳性率均显著高于重伤患者〔4.58±2.41比2.43±1.68，7.35%（5.90%，12.28%）比4.63%（3.26%，6.06%），均P<0.05〕。发生脓毒症的患者伤后1 d CD64指数和单核细胞CD279阳性率显著高于未发生脓毒症的患者〔4.06±1.72比2.36±1.31，3.29%（1.14%，12.84%）比0.67%（0.25%，1.48%），均P<0.05〕，伤后3 d淋巴细胞CD279阳性率显著高于未发生脓毒症的患者〔8.73%（7.52%，15.82%）比4.67%（3.82%，6.21%），P<0.05〕。此外，相关性分析显示，伤后1 d，淋巴细胞CD279阳性率与SOFA和ISS评分呈正相关（r值分别为0.533、0.394，均P<0.05）；单核细胞CD279阳性率与APACHEⅡ、SOFA和ISS评分呈正相关（r值分别为0.579、0.452、0.490，均P<0.01）；中性粒细胞CD279阳性率与APACHEⅡ和ISS评分呈正相关（r值分别为0.358、0.388，均P<0.05）。结论CD64指数和中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的CD279表达水平与创伤患者损伤严重程度及预后相关，监测细胞免疫功能可能对创伤预后评估具有重要意义。

简介：摘要目的探讨低物质的量浓度过氧化氢预处理对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）氧化应激性凋亡的作用及其机制。方法采用实验研究方法。通过全骨髓培养法从2只2周龄雄性BALB/c小鼠中分离培养BMSC，鉴定后取第3~7代对数生长期细胞进行实验。将细胞按随机数字表法（分组方法下同）分为用相应终物质的量浓度过氧化氢处理的0 μmol/L过氧化氢组（即不加入过氧化氢，下同）、25 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组、100 μmol/L过氧化氢组、150 μmol/L过氧化氢组、200 μmol/L过氧化氢组、250 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L过氧化氢组，培养24 h后，用流式细胞术检测细胞凋亡率（样本数为4）。将细胞分为用相应终物质的量浓度过氧化氢处理的0 μmol/L过氧化氢组、25 µmol/L过氧化氢组、50 µmol/L过氧化氢组、100 µmol/L过氧化氢组，培养24 h后，用蛋白质印迹法检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的蛋白表达，计算Bcl-2/Bax比值（样本数为3）。将细胞分为用相应终物质的量浓度过氧化氢处理的0 μmol/L过氧化氢组、25 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组、100 μmol/L过氧化氢组、200 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L过氧化氢组，培养24 h后，用蛋白质印迹法检测糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）及磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）的蛋白表达（样本数为3）。将细胞分为用相应终物质的量浓度过氧化氢处理的0 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L过氧化氢组，以及预先加入50 μmol/L过氧化氢刺激12 h再加入300 μmol/L过氧化氢的过氧化氢预处理组，培养24 h后，用倒置荧光显微镜（非荧光条件）和免疫荧光法观察细胞形态和生长情况，用流式细胞术检测细胞凋亡率，用蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9、剪切型caspase-3、剪切型caspase-9、GSK-3β及p-GSK-3β蛋白表达，计算Bcl-2/Bax比值，样本数均为3。对数据进行单因素方差分析、Bonferroni检验。结果培养24 h后，与0 μmol/L过氧化氢组比较，25 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组、100 μmol/L过氧化氢组细胞的凋亡率均无明显变化（P>0.05），150 μmol/L过氧化氢组、200 μmol/L过氧化氢组、250 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L过氧化氢组细胞凋亡率均明显上升（P<0.01）。培养24 h后，与0 μmol/L过氧化氢组比较，25 µmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组细胞Bcl-2/Bax比值均明显增加（P<0.05或P<0.01），100 µmol/L过氧化氢组细胞Bcl-2/Bax比值显著减少（P<0.05）。培养24 h后，与0 μmol/L过氧化氢组比较，25 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组细胞GSK-3β蛋白表达均无明显变化（P>0.05），p-GSK-3β蛋白表达均显著增加（P<0.01）；100 μmol/L过氧化氢组细胞GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达均无明显变化（P>0.05）；200 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L过氧化氢组细胞GSK-3β蛋白表达均明显增加（P<0.05），p-GSK-3β蛋白表达均显著减少（P<0.05）。培养24 h后，0 μmol/L过氧化氢组与50 μmol/L过氧化氢组细胞形态及生长情况相近，均正常，与之相比，300 µmol/L过氧化氢组细胞变小、变圆，细胞突起变短或消失，细胞核出现空化，细胞脱落明显增多；过氧化氢预处理组大部分细胞形态正常，细胞脱落少于300 µmol/L过氧化氢组，细胞核形态正常。培养24 h后，4组间细胞caspase-9蛋白表达相近（P>0.05）。与0 μmol/L过氧化氢组比较，50 μmol/L过氧化氢组细胞凋亡率以及剪切型caspase-9、caspase-3、剪切型caspase-3的蛋白表达均无明显变化（P>0.05），Bcl-2/Bax比值明显增加（P<0.05）；300 μmol/L过氧化氢组细胞凋亡率显著升高（P<0.01），剪切型caspase-9、caspase-3、剪切型caspase-3蛋白表达均明显增加（P<0.01），Bcl-2/Bax比值明显减少（P<0.05）。与300 μmol/L过氧化氢组比较，过氧化氢预处理组细胞凋亡率显著下降（P<0.01），剪切型caspase-9、caspase-3、剪切型caspase-3的蛋白表达均明显减少（P<0.05或P<0.01），Bcl-2/Bax比值显著增加（P<0.01）。培养24 h后，0 μmol/L过氧化氢组、50 μmol/L过氧化氢组、300 μmol/L 过氧化氢组、过氧化氢预处理组细胞GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达分别为1.09±0.14、0.62±0.17、1.35±0.21、0.74±0.34，0.68±0.03、0.85±0.08、0.38±0.10、0.54±0.09。与0 μmol/L过氧化氢组比较，50 μmol/L过氧化氢组细胞p-GSK-3β蛋白表达明显增加（P<0.05）；300 μmol/L过氧化氢组细胞GSK-3β蛋白表达明显增加（P<0.05），p-GSK-3β蛋白表达明显减少（P<0.01）。与300 μmol/L过氧化氢组比较，过氧化氢预处理组细胞GSK-3β蛋白表达明显减少（P<0.01），p-GSK-3β蛋白表达明显增加（P<0.01）。结论50 μmol/L可能是过氧化氢预处理小鼠BMSC的最佳物质的量浓度，50 μmol/L过氧化氢预处理通过抑制GSK-3β活性对抗线粒体途经的氧化应激性凋亡。