简介：摘要目的探讨携带泛素化修饰丁型肝炎抗原(hepatitis D antigen, HDAg)的树突状细胞来源的胞外体(dendritic cell derived exosomes，Dexs)在诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应中的作用及其分子机制。方法提取并诱导C57BL/6小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell，DC)后与Ub-S-HDAg-Dexs共孵育48 h，流式细胞仪检测表面分子[CD86、CD80、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ]的表达水平。提取C57BL/6小鼠脾源性T淋巴细胞与经胞外体刺激的DC共孵育后共培养72 h，分为Ub-S-HDAg-Dexs组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs)、Blank-Dexs组(加入50 μg/mL无质粒转染的DC来源胞外体)、Con-Dexs组(加入50 μg/mL经空白慢病毒转染的DC来源胞外体)、PBS组[加入50 μL/mL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)]、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs，经胞外体刺激的DC与T淋巴细胞混合时同时加入50 μmol/L AG490)，流式细胞术检测CD8与γ干扰素双阳性T细胞，非放射性乳酸脱氢酶检测试剂盒检测CTL细胞的杀伤活性。采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分别检测T淋巴细胞中Jak激酶(Janus kinase, JAK)2、GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)、T-bet、信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)1、STAT4的mRNA和蛋白质表达水平。统计学分析采用独立样本t检验。结果经Ub-S-HDAg-Dexs刺激，DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ阳性率为83.850%±0.219%、68.910%±0.134%、84.320%±0.445%。在Ub-S-HDAg-Dexs组，γ干扰素和CD8双阳性率为6.420%±0.028%, 高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(t＝90.78、30.32、63.06、85.42，均P<0.001)；细胞杀伤率为82.4%±3.9%，高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(t＝17.28、9.74、3.95、15.89，均P<0.050)。Ub-S-HDAg-Dexs组JAK2、T-bet、STAT1、STAT4 mRNA相对表达量分别与Con-Dexs组(t＝10.74、32.34、13.00、16.28，均P<0.001)、Blank-Dexs组(t＝15.05、21.51、6.46、13.12，均P<0.050)、PBS组(t＝21.83、41.42、7.30、17.50，均P<0.050)、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(t＝35.75、20.69、17.02、17.07，均P<0.001)相比，差异均有统计学意义。Ub-S-HDAg-Dexs组T-bet、STAT1、STAT4蛋白质表达水平高于PBS组，差异均有统计学意义(t＝346.70、57.54、55.81，均P<0.001)。Ub-S-HDAg-Dexs组加入AG490后，T-bet、STAT1、STAT4的蛋白质表达水平均较Ub-S-HDAg-Dexs组下降，差异均有统计学意义(t＝355.40、52.79、126.10，均P<0.001)。结论胞外体转运泛素化修饰的HDAg能有效促进DC成熟，诱导T淋巴细胞分化，产生特异性CTL反应，为丁型肝炎免疫治疗提供新的思路。

简介：摘要目的了解强制泛素化乙型肝炎核心抗原(ubiquitination of hepatitis B virus core antigen，Ub-HBcAg)对树突状细胞(dendritic cell，DC)自噬的影响，以及调节细胞自噬对DC抗原提呈功能和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应的作用。方法构建Ub-HBcAg慢病毒载体(lentiviral vector，LV，即为LV-Ub-HBcAg组)、无泛素化的乙型肝炎核心抗原(hepatitis B virus core antigen, HBcAg)重组慢病毒载体(LV-HBcAg组)和空载质粒慢病毒载体(LV组)，并分别转染至DC2.4细胞，设置空白对照组(NC组)。采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白P62、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B)、自噬相关蛋白5(autophagy related 5，ATG5)和自噬效应蛋白1(Beclin-1)的蛋白质相对表达量。流式细胞术检测DC表面共刺激分子CD86、CD80、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅱ的表达。CCK-8法检测T淋巴细胞增殖。非放射性的乳酸脱氢酶释放实验检测特异性CTL杀伤活性。统计学分析采用独立样本t检验。结果NC组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin-1和ATG5蛋白质相对表达量分别为0.445±0.076、0.522±0.026、0.761±0.038，分别低于LV-Ub-HBcAg组的0.926±0.021、0.919±0.016、1.451±0.028，而NC组P62相对表达量为1.875±0.016，高于LV-Ub-HBcAg组的0.647±0.121，差异均有统计学意义(t＝6.102、9.842、17.490、10.590，均P<0.01)。LV-Ub-HBcAg组DC的表面共刺激分子CD86(75.51%)、CD80(83.35%)和MHC-Ⅱ(66.66%)的表达也较高，NC组分别为8.03%、7.49%、0.04%。LV-Ub-HBcAg组特异性CTL杀伤率为(65.310±2.091)%，高于NC组的(14.400±0.497)%和LV-HBcAg组的(54.870±1.443)%，差异均有统计学意义(t＝23.690、4.111，均P<0.05)。结论Ub-HBcAg可促进DC自噬，并上调DC表面共刺激分子的表达，有利于DC成熟活化，并在泛素化作用下能更有效地激活T淋巴细胞功能，产生强烈的特异性CTL反应。