基于免疫荧光法的抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）亚型在系统性血管炎早期诊断中的应用

基于免疫荧光法的抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）亚型在系统性血管炎早期诊断中的应用

杨峻懿

武汉市普仁医院 430080

【摘要】目的：研究基于免疫荧光法的抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）亚型在系统性血管炎早期诊断中的应用。方法：应用间接免疫荧光法（IIF）检测1000例患者血清ANCA，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗髓过氧化物酶（MPO）抗体和抗蛋白酶3（PR3）抗体。结果：2005例患者共检出ANCA阳性51例，阳性率为2.54%，其中男性患者检出26例、女性患者检出25例。p-ANCA和c-ANCA两种荧光核型及靶抗原分布差异有统计学意义（P<0.05）。结论：ANCA的检测对血管炎及自身免疫性疾病的早期诊断和治疗极为重要，临床工作者应注重ANCA在系统性血管炎及自身免疫性疾病中的检测。

【关键词】免疫荧光法；抗中性粒细胞胞浆抗体；系统性血管炎

抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）是近些年针对以韦格纳肉芽肿（Wegener's granulomatosis， WG）为代表的系统性小血管炎的一类特定血清学标志性抗体，是一组以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。已有文献报道ANCA是一种诊断系统性血管炎的特异性指标，具有重要的临床意义[1]。近年来检测ANCA的技术发展很快，在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等许多结缔组织疾病患者血清中均能检测出ANCA[2-3]。本研究应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）对2005例患者进行了血清ANCA检测及回顾性分析。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2023年1月—2024年3月在本院住院和门诊检测ANCA的患者2005例，其中男998例、女1007例，年龄0～85岁。

1.2方法

在本研究中，采用了免疫荧光法（IIF）来检测抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）亚型，以下是详细的操作步骤：（1）样本准备：收集患者的血清样本，并进行适当稀释。（2）抗原底物准备：使用乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞作为标准实验基质。为了更好地进行荧光结果判读，建议同时结合HEp-2细胞等实验基质排除抗核抗体（ANA）的干扰。（3）IIF检测：将稀释后的血清样本与固定的中性粒细胞接触，使血清中的ANCA与中性粒细胞内的抗原结合。（4）洗涤：倒出未结合的血清，用1x PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除未结合的血清成分[4-5]。（5）二抗孵育：使用荧光素标记的抗人IgG抗体作为二抗，室温下避光孵育细胞1小时，以便二抗与结合在中性粒细胞上的ANCA结合。（6）再次洗涤：倒出二抗溶液，用1x PBS避光洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。（7）核染色：加入Hoechst荧光染料标记细胞核，室温孵育15分钟后再用1xPBS洗涤两次，每次5分钟。（8）封片观察：滴加一滴抗荧光猝灭封片剂于组织上，盖玻片封片，置于显微镜下观察拍照。（9）根据荧光模式将ANCA分为胞浆型（C-ANCA）和核周型（P-ANCA）。C-ANCA主要与蛋白酶3（PR3）相关，而P-ANCA主要与髓过氧化物酶（MPO）相关[6-7]。（10）数据记录：记录并分析每种ANCA亚型在不同患者样本中的分布和强度，以评估其在系统性血管炎早期诊断中的潜在应用价值。

1.3统计学方法

使用SPSS24.0统计学软件对数据进行处理，计数资料以（n/%）表示，计量资料则以（x±s）表示。另外，采用t值和χ2检验两种不同的方式进行分析。在P＜0.05的情况下，认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 ANCA的检测

在2005例患者中检出ANCA阳性51例，阳性率为2.54%。其中在998例男性患者中，ANCA阳性26例，阳性率为2.61%；在1007例女性患者中，ANCA阳性25例，阳性率为2.48%。男、女性患者间ANCA阳性率差异无统计学意义（χ2=2.850，P>0.05）。

2.2 ANCA靶抗原的分布

见表1。

表1ANCA靶抗原的分布（n,%）

3讨论

系统性血管炎（Systemic Vasculitis）是一组涉及全身多系统和多器官的炎症性疾病，其特征为血管壁的炎症和损伤。这些疾病通常表现为复杂的临床表现，诊断过程充满挑战。抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）是一组针对中性粒细胞胞浆成分的自身抗体，与多种系统性血管炎亚型相关，尤其是肉芽肿性多血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）。ANCA的检测对于血管炎的诊断、分类、预后评估及治疗监测具有重要价值。免疫荧光法作为一种传统的ANCA检测方法，因其操作简便、成本较低而被广泛采用。该方法通过观察中性粒细胞胞浆中ANCA的荧光模式，将ANCA分为两种主要类型：胞浆型（C-ANCA）和核周型（P-ANCA）。近年来，随着对ANCA亚型认识的深入，人们发现不同亚型的ANCA与特定的血管炎亚型有较强的相关性，为早期诊断提供了新的视角。

其中，ANCA最早（1882年）是由DAVIES等在6例原发性局灶节段坏死性肾小球肾炎患者的血清中检测到。VAN DER WOUDE在1985年发现WG患者血清中存在ANCA并认定其为WG的特异性血清学诊断标志物，此时ANCA的重要临床作用才得到认识[8-9]。研究发现不同年龄组患者ANCA的检测结果，ANCA阳性高发于中老年人，随年龄增长ANCA的阳性率增加。ANCA分为c-ANCA和p-ANCA 2种荧光核型，检测ANCA的基质片包括乙醇固定的中性粒细胞、甲醛固定的中性粒细胞、HEP-2细胞和猴肝组织，后二者的作用主要是排除抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）对检测的干扰。其中p-ANCA的主要靶抗原为抗MPO抗体，MPO是一种相对分子质量为146000的高阳离子化蛋白质，呈现核周平滑或细颗粒型荧光； c-ANCA的主要靶抗原为抗PR3抗体，呈现粒细胞胞浆颗粒型荧光[10-11]。另外，在51例阳性血清分析中，非MPO/PR3的p-ANCA和c-ANCA有8例，表明存在除PR3、MPO以外的靶抗原，包括溶菌酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶、乳铁蛋白和通透性增加蛋白等抗原，临床上还有待对其他特异性靶抗原作进一步证实。有研究表明，不同类型的ANCA和靶抗原对应不同疾病的发病率，PR3-ANCA主要引起WG，而MPO-ANCA主要引起显微镜下多血管炎。有研究表明，ANCA阳性与肾病有一定的关系，研究统计出3种类型肾病，分别为慢性肾炎、肾病综合征、急进性肾小球肾炎，其中尤以抗MPO抗体阳性率最高，原因为肾脏是原发性小血管炎受累的主要部位，其主要表现在狼疮肾炎、慢性肾炎、慢性肾功能不全及急进性肾小球肾炎等疾病中。此外，ANCA阳性还可见于硬皮病、结缔组织疾病等其他自身免疫性疾病患者中。总的来说，ANCA的检测对血管炎及自身免疫性疾病的早期诊断和治疗极为重要，临床工作者应注重ANCA在系统性血管炎及自身免疫性疾病中的检测。

参考文献：

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[6]刘静颖,杨洵哲,关鸿志,等.表现为肥厚性硬脑膜炎的孤立型抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎一例[J].中国临床案例成果数据库,2021,03(01):E136-E136.

[7]高稳超.ANCA相关性血管炎肾损伤伴狼疮性肾炎的临床病理特征及预后分析[D].郑州大学,2021.

[8]魏玉丹,崔燕,李婷婷,等.抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎合并多系统损害延误治疗获缓解1例报告[J].国外医学：泌尿系统分册,2020(4).

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[11]马小燕.抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在相关性血管炎中的诊断进展[J].中国科技期刊数据库医药,2021.