三代纳米孔病原微生物基因检测技术在重症肺炎患者中的临床应用

三代纳米孔病原微生物基因检测技术在重症肺炎患者中的临床应用

刘慧、万程伟、雷俊哥

赣州市人民医院、341000、江西赣州

摘要：目的 探讨三代纳米孔病原微生物基因检测技术在重症肺炎患者中的临床应用。方法 选取2024年1月到2024年10月就诊于我院的80例重症肺炎患者作为研究对象。通过电子支气管镜获取肺泡灌洗液，获取的肺泡灌洗液标本均分为三份，一份进行常规培养、一份进行PCR检测、一份随机分为两部分并分别进行二代测序、三代测序。比较不同检测方法的检测结果、诊断效能、检测报告时间和检测成本等。结果 三代测序的检测阳性率、敏感度均高于细菌培养及PCR（P＜0.05）；三代测序的检测阳性率、敏感度均高于二代测序，但无统计学差异（P＞0.05）。PCR检测所需时间最少，其次为三代测序，细菌培养及二代测序检测所需时间较长（P＜0.05）；细菌培养检测成本最少，其次为PCR，二代测序、三代测序检测成本较高（P＜0.05）。结论 与传统病原学检测相比，三代纳米孔病原微生物基因检测技术的诊断效能更好，对重症肺炎患者的诊治具有重要的意义。

关键词：三代测序；重症肺炎；病原微生物

呼吸道感染性疾病为呼吸系统常见病，随着人口老龄化的加剧，免疫受损人员增多，重症下呼吸道感染患者的数量也明显增多[1]。近年来，随着新发病原体的出现、免疫抑制宿主及耐药微生物的增加，感染的发病率和死亡率居高不下，尤其是重症肺炎，病死率高达30-50%[2]。重症肺炎患者往往病情进展迅速，一旦错过治疗时机，容易导致死亡及遗留各种并发症，而尽早明确病原微生物诊断并给予精准治疗，可显著降低死亡率，减少并发症，避免抗生素滥用，减轻患者经济负担[3]。针对病原微生物的传统检测方法检测周期较长、阳性率较低。二代及三代纳米孔病原微生物基因检测技术均是通过病原微生物核酸测序进行，虽然二代测序技术已在临床广泛开展，但受限于实验原理，测序速度相对较慢，而三代纳米孔病原菌微生物基因检测技术具有测序系列长、高速测序、实时分析以及鉴定耐药基因的特点[4]。本研究以重症肺炎患者的肺泡灌洗液作为样本，通过三代纳米孔病原菌微生物基因检测技术、二代测序及传统的肺泡灌洗液培养等方法在检测结果、时间和成本等方面进行比较，以期为快速精准的治疗，降低重症肺炎患者的病死率提供依据。

1对象及方法

1.1 研究对象 

本研究选取2024年1月到2024年10月于我院进行诊治的80例重症肺炎患者为研究对象。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）符合重症肺炎诊断标准[5]；（3）近半年未接受抗生素治疗；（4）行支气管肺泡灌洗检查；（5）临床资料完整；（6）患者及家属对本研究知情并签署同意书。排除标准：（1）合并恶性疾病；（2）合并血液或免疫系统疾病；（3）精神神经状况无法配合本研究；（4）妊娠期或哺乳期女性。

1.2检测方法

研究对象均通过电子支气管镜获取肺泡灌洗液，获取的肺泡灌洗液标本均分为三份，一份进行常规培养、一份进行聚合酶链式反应（PCR）检测、一份随机分为两部分并分别进行二代测序、三代测序。

肺泡灌洗液常规培养及鉴定：采用法国生物梅里埃公司VITEK2 Compact 全自动细菌鉴定系统检测。

PCR检测：将肺泡灌洗液，以4000 rpm离心10分钟。上清液适用于病毒检测，沉淀物适用于细菌、真菌检测。按试剂盒说明提取DNA/RNA。并进行扩增：初始变性（95°C，5分钟），以95°C变性30秒，55~60°C退火30秒，72°C延伸1分钟，进行30~40个循环后，终末延伸（72°C，5分钟）。荧光检测仪检测并记录Ct值。

二代测序检测方法：临床采集的标本，均送至圣庭医学检验中心进行检测，基于宏基因二代测序技术。

三代纳米孔测序技术：临床采集的肺泡灌洗液标本，均送至圣庭医学检验中心进行检测，依托高通量纳米孔测序系统，采用靶向扩增联合宏基因组测序，对样本中微生物核酸序列进行检测，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定及耐药基因鉴定。

1.3观察指标

比较不同检测方法的检测结果、诊断效能、检测报告时间和检测成本等。

1.4 统计学方法

用SPSS22.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（）表示，并采用t检验，计数资料采用[n(%)]表示，采用卡方检验。P＜0.05，表示差异有统计学意义。

2结果

2.1病原微生物检测结果比较

与三代测序相比，细菌培养及PCR检测阳性率均较低（P＜0.05）；二代测序检测阳性率均较低，但无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 病原微生物检测结果比较

注：与三代测序相比，*P＜0.05。

2.2 病原微生物检出种类比较

80例重症肺炎患者肺泡灌洗液中，细菌培养检测出1种病原微生物39例，2种病原微生物19例；PCR检测出1种病原微生物40例，2种病原微生物20例；二代测序检测出1种病原微生物24例，2种病原微生物11例，三代测序检测出1种病原微生物25例，2种病原微生物12例。见表2。

表2 不同检测方法病原微生物检出种类比较

2.3 诊断效能比较

三代测序的敏感度均高于细菌培养及PCR（P＜0.05）；三代测序的敏感度高于二代测序，但无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3 诊断效能比较

注：与三代测序相比，*P＜0.05。

2.4检测时间及成本比较

PCR检测所需时间最少，其次为三代测序，细菌培养及二代测序检测所需时间较长（P＜0.05）；细菌培养检测成本最少，其次为PCR，二代测序、三代测序检测成本较高（P＜0.05）。见表4。

表4 检测时间及成本比较

注：与细菌培养相比，aP＜0.05；与PCR相比，bP＜0.05；与二代测序相比，cP＜0.05。

3讨论

重症肺炎可引发多种危重症，甚至可导致死亡[6]。临床上，治疗重症肺炎过程中最重要的环节为针对病原微生物应用足量抗菌药物，但因存在多种病原微生物混合感染及细菌耐药情况，传统的强效抗感染药物往往无法取得理想疗效[7]。因而，重症肺炎的病原微生物检测是指导临床用药的关键。近年来，支气管肺泡灌洗技术逐步应用于重症肺炎的病原微生物检测和治疗[8-9]，不仅提高了病原学检测的准确性，同时为临床用药提供可靠依据，减少了耐药的发生[10-11]。本文以重症肺炎患者的肺泡灌洗液作为样本，分别进行三代纳米孔测序技术、二代测序及常规的细菌及真菌培养，并常规行聚合酶链式反应（PCR）等方法对样本的病原微生物进行检测，比较不同检测方法的检测结果、诊断效能、检测报告时间和检测成本等。

病原微生物的培养需要较长周期，且易受其他因素影响，进而影响病原学诊断的准确性[12]。PCR核酸扩增虽然具有灵敏、快速、非依赖培养等特点，但检测范围较窄，仅能针对已知病原微生物[13]。纳米孔测序可以实现实时、快速的 DNA/RNA 分析，无需PCR扩增，纳米孔检测时，孔内离子浓度和纳米蛋白结构可受核酸单链的影响，导致薄膜两端的电压改变，继而改变电流信号，不同碱基因结构不同，受纳米孔检测时所产生的电流信号不同，测序平台会实时将电流信号转化为碱基信号，从而实现高通量的 DNA/RNA 测序和分析[14-15]。此外，针对肺炎的纳米孔测序研究通常强调它能够进行全面的微生物筛查，从单一样本中检测出多种病原体。纳米孔技术的使用还有助于克服传统PCR诊断所面临的挑战，如灵敏度有限或无法检测新型病原体。三代测序技术具有测序系列长、高速测序、实时分析以及鉴定耐药基因的特点；而二代测序受限于建库及测序时间长、不能实时分析数据。因此三代纳米孔病原菌微生物基因检测技术的出现为重症肺炎的早诊、早治带来了曙光。本研究结果显示，三代测序的检测阳性率、敏感度均高于细菌培养及PCR（P＜0.05）；三代测序的检测阳性率、敏感度均高于二代测序，但无统计学差异（P＞0.05）。PCR检测所需时间最少，其次为三代测序，细菌培养及二代测序检测所需时间较长（P＜0.05）；细菌培养检测成本最少，其次为PCR，二代测序、三代测序检测成本较高（P＜0.05）。说明三代纳米孔病原微生物基因检测技术对重症肺炎患者肺泡灌洗液的检测较为快速、准确，有助于早期识别病原，缩短诊断时间，从而提高临床治疗效果。本研究80例重症肺炎患者肺泡灌洗液中，细菌培养检测出1种病原微生物39例，2种病原微生物19例；PCR检测出1种病原微生物40例，2种病原微生物20例；二代测序检测出1种病原微生物24例，2种病原微生物11例，三代测序检测出1种病原微生物25例，2种病原微生物12例。说明三代纳米孔病原微生物基因检测技术对重症肺炎患者肺泡灌洗液的检测覆盖的病原微生物较为全面，可为患者合理使用抗感染治疗提供理论依据。

综上所述，三代纳米孔病原菌微生物基因检测技术出现为重症肺炎患者提供新的技术方法和支撑。随着新发病原微生物、罕见病原体及多重耐药菌的出现，未来三代纳米孔病原菌微生物基因检测技术在重症肺炎患者病原体诊断中具有良好市场前景。

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基金项目：赣州市科技计划项目，2023ZSF080