平皿计数法与PCR检测法在生活饮用水菌落总数检测中的效果对比研究

平皿计数法与PCR检测法在生活饮用水菌落总数检测中的效果对比研究

韩进兰

云南省文山市疾病预防控制中心  云南文山   663000

【摘要】目的：通过利用平皿计数法与PCR检测法对生活饮用水菌落总数进行检测，针对两种方法的特性指标进行研究以及实际水样进行比对，验证PCR检测法的可靠性和优越性。方法：摘选2021年2月--2024年1月的180份生活饮用水样本作为研究对象，PCR检测法定为观察组，平皿计数法即为对照组，通过实验对比检测效果。结果：观察组菌落总数检出率、检测时长均优于对照组，P＜0.05具有临床统计学意义；研究组的检验耗时为（5.26±0.50）小时，而对照组的检验耗时为（27.30±1.25）小时。对比后有统计学意义，P＜0.05。结论：PCR检测法相较于传统的平皿计数法明显降低耗时，提高检出率，体现了该方法在疾控应急检测工作的重要价值和意义。

【关键词】平皿计数法；PCR检测法；

    长期以来，平皿计数法一直是最主要的检测手段。这种传统方法虽然能够对各种微生物样本进行检测，但其缺点也显而易见，包括检测所需时间较长以及检测灵敏度较低，这导致最终的微生物检出效果往往无法满足预期目标[1]。随着社会对微生物检测需求的日益增长，检测方法也在不断进步和更新。在这种背景下，PCR检测法的应用范围逐渐扩大，因其高灵敏度、低耗时和高检出率等显著优势而被广泛应用于微生物检验领域，并取得了显著的成果。鉴于此，本文摘选2021年2月--2024年1月的180份生活饮用水标本作为研究对象，分析两种检测方法的比对效果。

1. 资料与方法

1.1 资料

摘选2021年2月--2024年1月的180份生活饮用水标本作为研究对象，PCR检测法定为观察组，平皿计数法即为对照组。

1.2 方法

   对照组采用了传统的平皿计数法来进行菌落总数的计数，具体如下：以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1mL充分混匀的水样，注入无菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。 待冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上,置于36℃±1℃培养箱内培养48 h±2h,进行菌落计数，即为1 mL水样中的菌落总数。

    观察组采用了PCR检测法对水样中的菌落总数进行计数，操作步骤如下：1.水样采集: 在辖区内随机抽取生活饮用水，采用无菌操作直接采集，取水量500mL，4h内送至实验室。2.DNA提取:使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，从水样中提取细菌DNA。3.PCR扩增:配置PCR反应体系，包括引物、酶、缓冲液、dNTPs及提取的DNA模板。将反应体系置于PCR仪中，设置适当的扩增程序(如温度循环)，进行DNA扩增。4.琼脂糖凝胶电泳:制备琼脂糖凝胶，并将其置于电泳槽中。将PCR扩增产物与加载缓冲液混合后，点样于凝胶上。进行电泳，使DNA片段在电场作用下分离。使用紫外灯观察电泳结果，记录并分析条带的位置和亮度，以评估菌落总数。5.数据分析:根据电泳结果中的条带数量和亮度，结合已知的标准曲线或定量方法，计算水样中的菌落总数。

1.3 观察指标

计算检测结果（检出率）

1.4 统计学分析

    使用SPSS 27.0统计软件对本研究数据进行分析，计量资料用（均数±标准差）表示，T检验比较，计数资料表示为“百分比”，组间采用卡方检验比较，计算P值，当＜0.05时，分析统计学意义。

2. 结果

2.1 组间检测效果分析

    观察组检出率高于对照组，P＜0.05具有临床统计学意义。

表 1 组间检测效果分析[n/%]

2.2 检测耗时

    研究组的检验耗时为（3.50±0.50）小时，而对照组的检验耗时为（48±0.5）小时。对比后有统计学意义，P＜0.05.

3. 讨论

     水质检测是保障水资源安全和人类健康的重要环节。菌落总数是水体微生物污染程度的整体指示性指标，是评价水体卫生的重要指标，目前检测水中菌落总数的方法主要为平皿计数法，该法来自《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2023）规定，用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数，该方法自1985年使用至今已将近40年，没有更新，即在需氧情况下，于37 ℃培养48 h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。该方法具有一定的局限性：对于厌氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，方法条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长[2]；对于地表水等菌落总数较高的样品，检测需进行大量的稀释，人为误差较大；同时，该方法仅选取1 mL样品进行检测，地表水等水源水检测需要的稀释倍数较大，结果读数耗时且人为误差较大，试验操作中培养基温度要求严格，因此平皿计数法不能满足实验室大量样本及应急检测的需要。对于部分清洁样品来说，取样量较少，样本的代表性相对不足。PCR检测法是一种基于DNA扩增的水质菌落总数检测方法。它利用特定的引物和酶，在聚合酶链反应的条件下，扩增水样中细菌的DNA片段。通过测定扩增产物的数量可以间接测定水质菌落总数。PCR检测法具有高灵敏度和高特异性，并且可以快速得结果。PCR(聚合酶链反应)法因其高灵敏度、高特异性及快速检测的特点，在水质检测领域得到了广泛应用。鉴于PCR检测法测定水中菌落总数还未正式纳入相关水质标准中，且该方法所用试剂耗材价格相对较贵，PCR检测法可作为平皿计数法检测菌落总数的补充手段

[3]。PCR检测法在应急突发事件中现场检测方面有很大的应用前景，作为平皿计数法检测菌落总数的补充，将成为一种发展趋势，将来代替平皿计数法也未可知。

参考文献：
[1] 黄幼娜,张海凤,罗文明. 微生物检测技术在生活饮用水检验中的价值[J]. 食品安全导刊,2023(8):62-64,74.

[2] 姚静,刘若楠,王聪,等. 生活饮用水中菌落总数的测定方法优化[J]. 中外食品工业,2023(21):55-57.

[3] 徐新龙,杨杰,李玉龙,等. 浅析生活饮用水中水质微生物检测能力验证的结果与质量控制[J]. 食品安全导刊,2023(22):103-106,111.