姜黄素壳聚糖微球通过上调miR-224-3p改善溃疡性结肠炎炎症反应程度的机制研究

姜黄素壳聚糖微球通过上调miR-224-3p改善溃疡性结肠炎炎症反应程度的机制研究

武艳1，朱巧宏1，向艳茹1

(南昌大学第一附属医院中西医结合肛肠科，江西 南昌330006）

【摘要】目的 观察姜黄素壳聚糖微球(Curcumin chitosan microsphere,CCM)对溃疡性结肠炎治疗作用。方法 选取于南昌大学第一附属医院治疗的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）患者75例作为观察组，选取同期于本院体检的健康者80例作为对照组。选取成年雄性SD大鼠100只，大鼠随机分成5组，分别为模型组、阳性对照组、 CCM低剂量组、CCM中剂量组和CCM高剂量组，每组各20只，检测miR-224-3p与 TLR4等的靶向关系。 结果：经过治疗，柳氮磺胺吡啶片组、姜黄素组、CCM低、中、高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β的的含量明显降低，疗效有显著性差异（P<0.05）。miR-224-3p上调，与模型对照组和姜黄素组相比，有显著性差异。结论 CCM可能通过上调miR-224-3p而改善UC炎症反应程度。

【关键词】姜黄素壳聚糖微球,溃疡性结肠炎

          UC临床治疗较为棘手，且尚缺乏特异性、针对性的治疗药物。我们采用CCM干预UC大鼠探讨CCM在防治IBD中的作用机制。

1.UC患者血清miR-224-3p、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达（临床实验）

1.1病例资料

选取于2022年1月～2023年10月南昌大学第一附属医院门诊及住院确诊的UC患者75例作为观察组，选取同期于本院体检的健康者80例作为对照组，对照组与UC组相比年龄、性別构成差异无统计学意义，P<0.05。

1.2 标本采集及检测方法　采集两组对象空腹静脉血5ml，离心机3500r/min离心15min后提取上清液。ELISA法检测血清TNF-α、IL6、IL-1β水平。RT-PCR检测miR-224-3p相对表达量，

1.3 统计学分析

采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2. UC大鼠模型miR-224-3p、TLR4等的表达（动物实验）

2.1材料与方法

2.1.1 .1、姜黄素PLGA微球的制备

运用复乳溶剂蒸发法（W/O/W）制备 PLGA 微球。将 2g PLGA 溶解在 10 mL 二氯甲烷溶液中，将 100 mg 姜黄素以 10,000 rpm 转速搅拌 1 min 后分散于上述溶液中。将该有机物缓慢加入 40ml 浓度 1%（w/v）的 PVA（Av. Mw 30,000-70,000）水溶液中并以 10,000 rpm 的转速搅拌 3min。所得乳剂再加入 500 mL 浓度 0.1%（w/v）的 PVA 水溶液中并在 25℃以 250 rpm 的转速减压搅拌 6 小时。挥干二氯甲烷，离心筛选所得微球（50μm 和 100μm，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA），用无菌的双蒸去离子水洗脱 3 遍，然后真空干燥 24 小时。用同样的方法制备不含药物的空白微球。

2.1.1 .2 姜黄素PELA微球的制备

运用溶剂蒸发法（W/O/W）制备 PELA 微球。将 2g PLGA 溶解在 10 mL 二氯甲烷溶液中，将 100 mg 姜黄素以 10,000 rpm 转速搅拌 1 min 后分散于上述溶液中。将该有机物缓慢加入 40ml 浓度 1%（w/v）的 PVA（Av. Mw 30,000-70,000）水溶液中并以 10,000 rpm 的转速搅拌 3min。所得乳剂再加入 500 mL 浓度 0.1%（w/v）的 PVA 水溶液中并在 25℃以 250 rpm 的转速减压搅拌 6 小时。挥干二氯甲烷，离心筛选所得微球（50μm 和 100μm，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA），用无菌的双蒸去离子水洗脱 3 遍，然后真空干燥 24 小时。用同样的方法制备不含药物的空白微球。

2.1.1 .3、姜黄素壳聚糖微球的制备

a.取一定量的壳聚糖(浓度为 0.5 mg/mL-4 mg/mL)溶解于 1%的乙酸溶液中，用 NaOH 溶液调节 pH 值至 5。b.用厚度为 0.45 µm 和 0.22 µm 的滤纸依次进行过滤；c.取一定量的三聚磷酸钠(TPP)，用双蒸水溶解，配置成 0.54 mg/mL 的 TPP 溶液;d.依次用厚度为 0.45 µm 和 0.22 µm 的滤纸进行过滤；e.将 CS 溶液与 TPP 溶液按 5:1 的比例，将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入（30 滴/min）壳聚糖溶液中，观察实验现象，当有微球形成时,溶液由澄清变为有蓝色光出现,有少许泡沬生成，磁力搅拌 30 min。

15000 r/min 离心 15 min,所得沉淀物纯水洗涤三次,收集沉淀物冷冻低温负压冻干。

2.1.1 .4、载药量和包封率的测定

精密称取自制姜黄素微球1mg，加入1ml冰醋酸超声使其充分溶解，离心，上清液用流动HPLC相稀释50倍，测定。将所得峰面积值代入标准曲线，计算出溶液中姜黄素的浓度，进而计算出微球中的姜黄素含量，按下式计算微球载药量及包封率：

载药量=(微球中药物的量/微球质量)×100%

包封率=(微球中药物的量/投入药量)×100%

2.1.2  IBD模型建立

选取成年雄性SD大鼠100只，大鼠随机分成5组，分别为模型组、阳性对照组、 CCM低剂量组、CCM中剂量组和CCM高剂量组，每组各20只，检测miR-224-3p与 TLR4等的靶向关系。

2.1.3  实验分组给药

正常对照组：正常饮水、饮食；模型组：5%DSS自由饮水，正常饮食；柳氮磺胺吡啶片组：5%DSS自由饮水+含5g/L柳氮磺胺吡啶的饲料喂养；姜黄素组：5%DSS自由饮水+含20g/L姜黄素的饲料喂养；CCM低剂量组：5%DSS自由饮水+含CCM的饲料喂养（10g/L）；CCM中剂量组：5%DSS自由饮水+含CCM的饲料喂养（20g/L）；CCM高剂量组：5%DSS自由饮水+含CCM的饲料喂养（40g/L）。

2.2、 观察指标

2.2.1 肠组织形态学及炎症评分

处死大鼠，取肠组织置于10%中性福尔马林液固定24小时，做常规石蜡切片。按HE染色步骤操作，对切片进行染色，采用光学显微镜观察各组大鼠的肠组织病理形态改变，并给予炎症评分。

2.2.2 组织学损伤评分：参考Dieleman等［1]制定的标准，以结肠粘膜损伤点的长度计算作为结肠损伤分数方法。1分：≤0.5mm；2分：≤1mm；3分：≤2mm；以次类推，损伤点宽度≥2mm时，分数加倍。

2.2.3  Western Blotting检测各组小鼠miR-224-3p、TLR4与NF-kB的的含量

收集各组大鼠结肠组织，采用Western blot法检测肠组织中miR-224-3p、TLR4与NF-kB的蛋白表达水平。

2.2.4  炎症因子表达水平

收集各组大鼠结肠组织，制备组织匀浆，采用ELISA法检测组织匀浆上清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，方法按试剂盒说明书进行。

2.2.5 统计学方法

统计学分析应用SPSS 17.0，以频数表示计数资料，以±S表示计量资料，采用t检验的方法进行两组间对比。治愈率比较采用x2检验。

3.结果

3.1  对照组与观察组患者血清miR-224-3p、TNF-α、IL-6、IL-1β的变化

观察组TNF-α、IL-6、IL-1β的表达明显增高，miR-224-3p明显降低, 差异有统计学意义(P<0.05)，见表1

表1   两组血清miR-224-3p、TLR4、TNF-α、NF-κB的变化 (±S)

注:与对照组比较,* P<0.05

3.2. 病理结果

模型组大鼠结肠粘膜遭严重破坏，部分有缺损，粘膜内腺体排列紊乱、变形； CCM低、中、高剂量组组及柳氮磺胺吡啶片组大鼠病变较轻，粘膜较为完整，正常对照组大鼠结肠组织结构规则，腺体排列整齐。        

3.3各组大鼠结肠损伤评分比较

模型组、柳氮磺胺吡啶片组、CCM低、中、高剂量组均表现为溃疡形成，模型对照组为最高评分；2～4周治疗后，柳氮磺胺吡啶片组、姜黄素组、CCM低、中、高剂量组与模型对照组相比，结肠黏膜形态学损伤评分显著降低，有显著性差异（P<0.01）。CCM高剂量组和柳氮磺胺吡啶片组相比,疗效有显著性差异（P<0.05）,而CCM低、中剂量组和柳氮磺胺吡啶片组相比,疗效无显著性差异（P）0.05）。CCM低、中、高剂量组和姜黄素组相比,疗效有显著性差异（P<0.05）。

表2  各组大鼠结肠损伤评分比较（±s，n=20）

注：与模型对照组比较﹡P<0.01; 与柳氮磺胺吡啶片组

bP＜0.05; 与姜黄素组比较aP＜0.05

3.4 各组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量

经过治疗，柳氮磺胺吡啶片组、姜黄素组、CCM低、中、高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明显降低，柳氮磺胺吡啶片组、姜黄素组、CCM低、中、高剂量组与模型对照组相比，有统计学意义（P＜0.01）。CCM高剂量组和柳氮磺胺吡啶片组相比,疗效有显著性差异（P<0.05）,而CCM低、中剂量组和柳氮磺胺吡啶片组相比,疗效无显著性差异（P）0.05）。CCM低、中、高剂量组和姜黄素组相比,疗效有显著性差异（P<0.05）。

表3 各组TNF-α、IL-6、IL-1β的变化（±s）

注：与模型对照组比较*P<0.01; 与柳氮磺胺吡啶片组bP＜0.05; 与姜黄素组比较aP＜0.05

3.5  Western Blotting检测各组miR-224-3p、TLR4与NF-kB的的含量

我们使用Western blot检测了各组miR-224-3p、TLR4与NF-kB的的含量，结果发现CCM低、中、高剂量组都能增强了miR-224-3p的表达水平，降低TLR4与NF-kB的的含量，与模型对照组和姜黄素组相比，有显著性差异。

表3 各组miR-224-3p、TLR4与NF-kB的变化（±s）

注：与模型对照组比较*P<0.01; 与柳氮磺胺吡啶片组bP＜0.05; 与姜黄素组比较aP＜0.05

4. 讨论

临床IBD患者的生理病理发展核心为肠道粘膜免疫炎症反应异常，而目前临床治疗IBD患者的主要策略也是抑制免疫炎症反应。但目前对美沙拉嗪无反应患者可应用的治疗性药物非常有限，系统性应用皮质类固醇激素、生物制剂或者免疫调节剂等易导致发生严重的副作用。TLR4异常活化及其下游信号通路激活所介导的上皮紧密连接破坏是IBD发病的关键环节。而调控TLR4信号通路介导的上皮紧密连接可能是防治IBD的新思路。miR-224-3p是miR-224家族的成员，目前关于miR-224的研究相对较少，主要集中在其在肿瘤相关疾病中的作用。大量研究表明，姜黄素具有抗IBD的作用[2-3]。但由于姜黄素稳定性较差，在水中不易溶解，且体内代谢半衰期较短，故不易制备成片剂、胶囊剂或注射剂等剂型，大大限制了其临床应用。PLGA、壳聚糖作为生物相容性较好的可降解材料，可以作为药物缓释的载体，提高药物的利用率，促进药物通过小肠粘膜的吸收，在肠道疾病药物缓释中具有良好的前景。而我们科研团队在姜黄素壳聚糖微球治疗IBD的过程中发现，经过治疗，柳氮磺胺吡啶片组、姜黄素组、CCM低、中、高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明显降低，CCM低、中、高剂量组都能增强了miR-224-3p的表达水平，降低TLR4与NF-kB的的含量，与模型对照组和姜黄素组相比，有显著性差异。CCM可能通过上调miR-224-3p在肠粘膜中发挥促炎作用，通过抗炎作用而达到减轻大鼠溃疡性结肠炎中结肠组织的损伤，从而抑制或逆转IBD病程进展，这也提示后者可以作为炎症性肠炎的潜在治疗靶点。

参考文献：

1. Laukoetter M G, Nava P, Nusrat A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J]. World Journal of Gastroenterology, 2008, 14(3):401-407

2.Z. He, M. Jia, Y. Yu, C. Yuan, J. Wang, Roles of SDF-1/CXCR4 axis in cartilage endplate stem cells mediated promotion of nucleus pulposus cells proliferation, Biochemical and biophysical research communications 2018;506: 94-101.

3.S. Hinderer, K. Sudrow, M. Schneider, M. Holeiter, S. L. Layland, M. Seifert, K. Schenke-Layland, Surface functionalization of electrospun scaffolds using recombinant human decorin attracts circulating endothelial progenitor cells, Scientific reports 2018;8: 110-111.

课题立项：2021年度江西省教育厅科学技术研究项目

项目编号：GJJ210131，课题名称：姜黄素壳聚糖微球通过上调miR-224-3p改善溃疡性结肠炎炎症反应程度的机制研究