基因工程促进脂肪干细胞成骨分化的研究进展

基因工程促进脂肪干细胞成骨分化的研究进展

杨松，田兵，董臣，王鑫*

黑龙江省医院 黑龙江哈尔滨，150036

摘要：本文探讨基因工程促进脂肪干细胞成骨分化的研究进展。ASCs作为多向分化潜能的干细胞，在骨组织工程领域潜力巨大。文章分析了ASCs成骨分化过程及关键步骤，探讨了BMPs、TGF-β等生物因子及其作用机制。分析了成骨分化中基因及蛋白质表达变化的重要性。深入解析了BMP、Hedgehog、Wnt、Notch及FGF五大信号通路的作用机制、关键分子及相互作用关系，揭示了复杂调控网络。

关键词：骨组织再生；ASCs成骨分化； BMP信号通路

1 骨组织再生

大段骨缺损是骨科和整形外科领域中常见的严重问题，它不仅显著影响患者的功能和外观，也是医疗系统的重大负担和医生面临的紧迫挑战。对于较大面积的骨缺损，临床上主要采用骨移植的方法进行修复。自体和同种异体骨移植是修复骨缺损的首选临床材料。然而，尽管骨移植可以较为有效地治疗较大面积的骨缺损，但也存在供区骨组织有限、易坏死等缺点。因此，在过去的几十年中，骨组织再生、干细胞移植等治疗方法为修复大量骨组织缺失提供了新的策略。影响骨再生的因素主要包括四个方面：最重要的是具有分化增殖能力的原始细胞，即干细胞；还需要调控成骨的多种生物活性物质，如细胞因子及其受体；此外，适合细胞生长、利于恢复原有骨形态及连续性的微环境和框架结构，以及机体本身提供的血供和营养成分也是必不可少的。

2 ASCs成骨分化

2.1 ASCs成骨分化过程

ASCs（脂肪来源的间充质干细胞）分化成成熟的骨组织的过程主要分为两个阶段。首先，ASCs逐渐分化为成熟的成骨细胞。随后，在第二阶段，这些成熟的成骨细胞开始分泌骨基质，并通过钙化过程形成新的骨组织。通过组织化学染色技术，可以观察到不同分化阶段细胞形态的变化。在体外进行成骨诱导3至5天后，ASCs从梭形转变为不规则形状，细胞核变大且变得圆润；10至15天时，细胞开始形成矿化结节，细胞间出现红色的钙质沉积；到了14至21天，细胞变得宽大扁平，并出现大小不一的球形矿化结节。

2.2 ASCs成骨分化的诱导因子

成骨分化过程中最常用的诱导因子包括地塞米松、β-甘油磷酸盐和抗坏血酸2-磷酸盐，这些也是构成成骨培养基的关键成分。除此之外，其他成骨诱导因子如维生素D3、富含血小板的血浆、硒、电磁场和机械力等也发挥着重要作用。此外，BMPs、Hedgehog、Wnt、Notch、VEGF等生长因子也参与了ASCs（成人干细胞）向成骨细胞的分化过程。

2.3 ASCs成骨分化的相关基因及蛋白质表达

在持续的分化过程中，成骨细胞会表达多种与成骨相关的因子。特异性转录因子Runx2，作为转化生长因子β（TGF-β）和BMP等信号通路的共同节点，其表达的上调能够增强骨钙蛋白（OCN）、I型胶原等成骨基因的表达，从而促进前体间充质干细胞（ASCs）向成骨细胞的转化。Osterix同样是骨组织发育中不可或缺的特异性转录因子，它促使ASCs最终转变成成骨细胞。此外，在成骨细胞的再分化过程中，还会产生多种细胞外基质蛋白，除了上述的OCN和I型胶原，还包括碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨唾液酸蛋白（BSP）等。其中，ALP是成骨分化早期的标志物，而OPN和OCN则是成骨分化晚期的标志物。在运用基因编辑技术调控ASCs成骨分化时，通过检测这些标志性基因的表达，可以在一定程度上评估ASCs向成骨细胞分化的成熟程度。

3 ASC成骨分化的主要信号通路

3.1 BMP信号通路

BMP（骨形态发生蛋白）是转化生长因子-β（TGF-β）超家族的一员，能够与细胞表面的BMP受体（BMPR）结合，激活Smad蛋白的经典信号传导途径，进而促进骨骼的形成。BMPR属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，当BMP与BMPR结合后，会触发受体对Smad蛋白（Smad1/5/8）的磷酸化作用。随后，Smad4与磷酸化的Smad蛋白相互作用，形成异源二聚体复合物，并迁移到细胞核内，调节Runx2和Osterix的表达，从而刺激碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）以及I型胶原蛋白的转录合成。此外，BMP还能激活Smad非依赖的信号通路，通过MAPK级联反应激活ERK1/2、p38和JNK，进一步促进细胞的骨再生。在已知的16种BMP亚型中，BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9被认为具有最强的成骨诱导能力。在促进碱性磷酸酶活性方面，异源二聚体形式的BMP-2/6、BMP-2/7和BMP-4/7比单一类型的BMP同源二聚体效果更佳。另外，Noggin和Chordin蛋白是BMP的天然抑制剂，它们通过竞争性结合到BMPR上，阻止BMP信号的传递。通过敲除Noggin基因或Chordin基因，可以增强BMP的功能，促进成骨分化。这种方法同样可以减轻因BMP信号过度表达而引起的炎症和异位骨化等副作用。

3.2 Hedgehog信号通路

Hedgehog（HH）信号通路在细胞生长和分化中起着至关重要的作用。当HH配体（如Sonic Hedgehog（SHH））与Ptch-1受体结合时，HH途径的典型激活发生。这种结合减轻了Ptch-1对Smoothened（SMO）转导蛋白的抑制，使SMO能够积累和向下游传播信号。因此，这导致Gli激活剂（GliA）的激活，然后转移到细胞核并诱导BMP-2基因的表达。此外，研究表明，在含有重组BMP-2的分化培养基中培养的ASCs表现出SHH、Ptch受体和Gli1的高表达，这些是SHH信号通路的标志物。这表明HH和BMP信号之间存在双向相互作用，促进ASCs的成骨分化。

3.3 Wnt信号通路

Wnt蛋白属于哺乳动物分泌的糖蛋白家族，它们在胚胎发育、组织诱导以及细胞增殖和分化等过程中扮演着关键角色。经典的Wnt信号通路，亦称为Wnt/β-连环蛋白途径，涉及Wnt蛋白与FZ受体以及LRP5/6的结合。这一相互作用导致β-连环蛋白保持非磷酸化状态，并逐渐累积，最终转移到细胞核内。在那里，β-连环蛋白作为转录辅助激活因子，参与调控靶基因的转录，进而促进成骨分化。研究已经证实，这一典型的Wnt信号通路对于正常的骨骼发育至关重要。在非经典的Wnt信号通路中，Wnt蛋白与受体ROR1/ROR2结合，触发G蛋白的活化，并导致内质网中Ca2+的释放。作为第二信使，Ca2+在成骨细胞增殖相关的信号传导路径中发挥着关键作用。

3.4 Notch信号通路

Notch信号通路在细胞分化中扮演着至关重要的角色，尤其是在成体干细胞（ASCs）向成骨细胞分化的过程中，它可能同时具有促进和抑制的双重调节作用。当Notch与其配体结合并发生水解后，会释放出Notch胞内域（NICD），该域能够从细胞膜上脱离并进入细胞核内。在核内，NICD与转录因子CSL结合，进而上调Runx2的转录水平，从而对成骨分化施加正面影响[14]。然而，也有研究指出，Notch-1的过度表达可能会与Wnt信号通路的经典途径发生相互拮抗作用。具体来说，过量的NICD能够抑制Wnt3a的表达，并降低碱性磷酸酶（ALP）的活性，这表明Notch-1在成骨分化中可能起到负面调节作用。

3.5 FGF信号通路

FGFs 构成一个蛋白质家族，它们能够调节包括成骨在内的多种细胞过程。FGFs 对于软骨内和膜内骨化的形成至关重要。将FGF与FGFR结合能够激活多种信号转导途径，包括MAPK、磷酸肌醇激酶以及蛋白激酶C通路等。这种多重信号传导导致ASCs的增殖和分化增加以及成骨细胞的功能增加。研究表明，FGF2、FGF9、FGF18均会不同程度地促进ASCs的增殖和成骨分化。通过调节通路中关键转录因子的表达可以促进ASCs成骨分化，那么如何调控通路中的相关转录因子，以更好地实现骨再生成为了研究的关键。基因工程技术的出现为有效调控相关通路中的转录因子提供了新的解决思路。

结语

综上所述，基因工程技术在促进脂肪干细胞成骨分化方面取得了显著进展，为骨组织工程提供了新的策略和思路。通过精准调控成骨分化过程中的关键基因和信号通路，不仅提高了ASCs向成骨细胞分化的效率，还增强了新生骨组织的结构和功能。未来，随着对ASCs成骨分化机制认识的不断深入和基因编辑技术的快速发展，我们有理由相信，基于ASCs的骨组织再生策略将在临床应用中展现出更加广阔的前景，为解决骨缺损、骨折不愈合等临床难题提供更为有效的解决方案。

参考文献

[1]赵鹏.人VEGF基因修饰脂肪源间充质干细胞的成骨特性研究[D].南华大学,2020.

[2]刘俊伟.生长分化因子11对脂肪干细胞成脂分化及脂肪代谢的影响[D].暨南大学,2018.

[3]赵崇如.锶对脂肪干细胞成骨分化中VEGF表达及Notch信号通路相关蛋白表达的影响[D].中国医科大学,2018.

[4]唐宇欣,金晗,史册,等.脂肪干细胞及其向成骨细胞分化的调控机制[J].国际口腔医学杂志,2014,41(04):418-423.

基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2021H067)

通讯作者：王鑫 E-mail：pepper520@126.com