重组牛碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达,纯化及其生物活性检测

重组牛碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达,纯化及其生物活性检测

陈锦辉

珠海亿胜生物制药有限公司  广东省珠海市  519070

摘要

背景：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在细胞增殖、分化和组织修复中扮演重要角色。为了满足科研和生物制药的需求，开发高效生产bFGF的方法尤为重要。

目的：本研究旨在建立在大肠杆菌中高效表达、纯化重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rbFGF）的方法，并评价其生物活性。

方法：使用工程菌株JM-bFGF，通过菌株活化、发酵培养、菌体收集、菌体均质裂解、离心、离子交换层析和亲和层析纯化获得rbFGF。使用SDS-PAGE和Western Blot进行纯度和表达量分析，并通过细胞增殖和伤口愈合实验检测纯化蛋白的生物活性。

结果：成功在大肠杆菌JM-bFGF中高效表达并纯化了rbFGF，纯化后的rbFGF纯度超过90%。生物活性检测显示rbFGF能显著促进成纤维细胞增殖。

结论：本研究提供了一种在大肠杆菌JM-bFGF中高效生产rbFGF的方法，产物具有良好的生物活性，显示出在科研和应用中的潜力。

关键词: 重组牛碱性成纤维细胞生长因子，大肠杆菌JM-bFGF，表达，纯化，生物活性

1.引言

本研究使用JM-bFGF工程菌株在大肠杆菌中表达rbFGF，通过一系列纯化步骤获得高纯度rbFGF，并通过体外生物学实验验证其活性，为其工业化生产和应用奠定基础。

2.材料与方法

2.1 实验材料

研究中使用的材料包括JM-bFGF（自建菌株）， 含卡那霉素（50 µg/mL）的LB培养基（杭州微生物试剂厂，中国），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，E. Merck，德国），合成bFGF基因（Thermo Fisher Scientific，美国），CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱（GE公司，美国），Heparin-Sepharose CL-6B亲和层析柱（GE 公司，美国），BCA蛋白质定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国），CCK-8细胞增殖试剂盒（Beyotime，中国），结晶紫（Sangon Biotech，中国），10%胎牛血清（Gbico，美国），MTT试剂盒（碧云天，中国），NIH 3T3细胞（中国科学院细胞库）。

2.2 菌株活化与发酵培养

取本实验室冻存的JM-bFGF菌株，划线接种于LB固体培养基，37℃培养12-16小时。单菌落接种于50 mL LB液体培养基，37℃、200 rpm培养至OD600约0.6-0.8。将种子液接种于2 L发酵罐中的1 L LB培养基，接种量为2%。在37℃、200 rpm下培养至OD600约1.0-1.2。添加终浓度为0.5 mM的IPTG，25°C、200 rpm下继续培养4小时。

2.3 菌体收集与裂解

培养结束后，发酵液于4°C、8000 rpm离心10分钟，收集菌体沉淀。将菌体沉淀悬浮于50 mL裂解缓冲液（0.1MNaCl-25mMPB（pH7.0））。使用高压均质机在600 bar下处理菌体4次，确保菌体充分破碎。裂解液4°C、12000 rpm离心30分钟，收集上清液作为粗提液。

2.4 蛋白质纯化

粗提液上样至CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱，平衡缓冲液为0.1MNaCl-25mMPB（pH7.0）。使用含0-1 M NaCl的梯度缓冲液（0.1、0.2、0.6M NaCl-25mMPB，pH7.0）洗脱，线速度不超过60cm/h，收集0.6MNaCl-25mMPB（pH7.0）洗脱活性峰。收集的洗脱液体在2～8℃环境下保存，但不能超过12个小时。

2.5 纯化效果分析

选取适量收集的洗脱液，8000 rpm，4℃离心5min。随后，将样品置于12% SDS-PAGE凝胶，电泳后考马斯亮蓝染色，观察rbFGF条带，评估rbFGF的纯化情况。并通过western blot方法鉴定rbFGF。即电泳后将蛋白转移至PVDF膜，使用抗bFGF抗体和HRP标记的二抗检测，ECL显色。使用BCA蛋白质定量试剂盒测定纯化后rbFGF的浓度。

2.6 MTT实验检测rbFGF生物活性

选择NIH 3T3细胞系，置于含10% 胎牛血清和双抗的DMEM培养基中，于37℃和5% CO2的培养箱中培养。然后将细胞转移至96孔板中，密度为 5,000–7,000 个细胞/100 μL/孔。参考前人的研究方法（PMID: 38375209），在饥饿处理后的细胞中加入不同浓度的rbFGF（0, 1, 5, 10, 50 ng/mL）。使用MTT试剂盒在24小时、48小时和72小时检测细胞增殖情况，570nm下测定吸光度。

1. 表达载体构建与验证

将从基因公司定制合成的rbFGF基因克隆至 pET-28a载体中，通过酶切反应在适当条件下形成重组质粒，并将其转化到感受态大肠杆菌中，通过筛选得到阳性克隆质粒。使用限制性内切酶酶切分析鉴定，结果如图1a。诱导后，通过工程菌株JM-bFGF成功在大肠杆菌中高效表达了rbFGF（图1b）。发酵培养后通过离心收集菌体，随后通过高压均质裂解获取菌体粗提液。

图1 rbFGF表达载体的构建及验证。a.重组质粒的限制性酶切鉴定；b.大肠杆菌中表达的rbFGF蛋白的SDS-PAGE分析。

2. 纯化结果

通过离子交换层析和亲和层析成功纯化rbFGF。SDS-PAGE结果显示在18 kDa处的主要蛋白条带（图2a）。Western Blot分析显示rbFGF具有良好的特异性（图2b）。BCA法测得蛋白浓度为1.5 mg/mL。

图2 rbFGF蛋白的纯化。a.纯化后重组蛋白的SDS-PAGE鉴定；b.Western blot特异性鉴定rbFGF蛋白。

3. 细胞增值实验检测rbFGF生物活性

利用MTT 实验测定rbFGF的生物活性。结果显示，随着rbFGF浓度的增加，细胞活力同样增加，在5–50 ng/mL浓度范围内显著促进NIH 3T3细胞增殖（图3）。细胞增殖率与rbFGF浓度呈正相关，在50 ng/mL时达到最大增殖率（提升约200%）。这些结果表明本研究获得的rbFGF具有生物活性。

图3 细胞增值实验测定rbFGF的生物活性。* p < 0.05，具有统计学意义。

讨论

本研究成功构建rbFGF表达载体，并在大肠杆菌中成功表达。通过离子交换层析和亲和层析结合的方法纯化rbFGF，提升了rbFGF的蛋白浓度。同时，细胞增值实验证明了本研究中获得的rbFGF的有效性。这为rbFGF的应用提供思路。

参考文献

1. Ornitz, D. M., & Itoh, N. (2001). Fibroblast growth factors. Genome Biology, 2(3), reviews3005.
2. Mohammadi, M., Olsen, S. K., & Goetz, R. (2005). A protein kinase chaperone complex guides the activation of receptor tyrosine kinases. Nature, 433(7025), 531-537.
3. Powers, C. J., McLeskey, S. W., & Wellstein, A. (2000). Fibroblast growth factors, their receptors and signaling. Endocrine-Related Cancer, 7(3), 165-197.