复方保健食品增强小鼠免疫力功能研究

复方保健食品增强小鼠免疫力功能研究

孙艺

广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所  广东广州  510610

摘要：目的 研究复方保健食品增强小鼠免疫功能作用。方法 经口灌胃给予小鼠0.15、0.30、0.90 g/kg·BW剂量的复方保健食品30天，按《保健食品功能检验与评价方法》中“有助于增强免疫力检验方法”，测定小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性，对复方保健食品增强免疫力功能进行评价。结果：各剂量组小鼠足跖肿胀度与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。中、高剂量组小鼠溶血空斑数、半数溶血值与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）。中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。结论：依据《保健食品功能检验与评价方法》中结果判定标准，受试复方保健食品有助于增强免疫力。

关键词：复方保健食品；细胞免疫；体液免疫；单核一巨噬细胞吞噬功能；NK细胞活性

现代医学认为免疫力是机体识别和消灭外来异物，处理机体衰老、损伤、变性、死亡等细胞的能力，是机体排除“异己”、保护自身的防御机制，机体是一个平衡体，免疫是维持机体平衡的重要机制，而免疫失衡则是百病之源。中医诊治疾病的思维方式也是“平衡”，与现代医学中免疫的理论不谋而合。中药保健食品是在中医理论的指导下，根据科学的组方原则，所形成的复方保健食品，在增强免疫力方面成效显著。与中药治病的目的不同，中药保健食品则可以在机体处于免疫力低下的亚健康状态时进行干预，提高消费者的免疫力，降低各种疾病发生的概率，达到“治未病”的目的[1]。

丹参味苦，性微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀，凉血养血，通经止痛，清心除烦的功效。三七味甘、微苦，性温，归肝、胃经，具有散瘀止血，益气养血，滋阳强壮，消肿定痛的功效。山楂味酸、甘，性微温，归脾、胃、肝经，具有消食健胃，行气散瘀，健脾助运，补虚扶正的功效。研究表明，丹参、三七、山楂单方或配伍使用具有增强免疫力功能[2-6]，因此我们以丹参提取物、三七提取物、山楂提取物为原料制备复方保健食品，并对其增强小鼠免疫力功能进行研究验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料

受试物是以丹参提取物、三七提取物、山楂提取物为原料制成的片剂，规格为0.6g/片，人体推荐用量每日1次，每次3片，组方原料丹参提取物采用60%乙醇提取制得，每日用量0.45g，三七提取物采用60%乙醇提取制得，每日用量0.3g，山楂提取物采用50%乙醇提取制得，每日用量0.6g。

1.2  实验动物及环境

SPF级雄性ICR小鼠160只，体重18～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2021-0002。实验动物在屏障环境中饲养，实验期间温度为22℃～25℃，湿度为45%～50%。

1.3实验分组及剂量选择

将160只实验小鼠随机分为四大组，免疫I组进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、抗体生成细胞和血清溶血素测定；免疫II组进行小鼠碳廓清实验；免疫III组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫IV组进行小鼠脾淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定。免疫I组、免疫II组、免疫III组、免疫IV组分别设低、中、高剂量组和阴性对照组，每组10只。低、中、高剂量组按人体推荐用量的5、10、30倍设定剂量为0.15、0.30、0.90 g/kg·BW，阴性对照组给予蒸馏水，各组均按20 mL/kg·BW灌胃，每日1次，连续给予30天，每周根据体重调整灌胃量。

1.4 检测指标

1.4.1 脏器/体重比值测定：小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算胸腺/体重比值、脾脏/体重比值。

1.4.2 迟发型变态反应实验：每只小鼠腹腔注射2%（v/v）绵羊红细胞（SRBC）0.2mL，致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）SRBC，注射后于24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值（足跖肿胀度）来表示DTH的程度。

1.4.3 小鼠脾淋巴细胞转化实验：处死小鼠，无菌取脾，制成单个细胞悬液，调整细胞浓度，取细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，其中一孔加入75μL ConA液，另一孔作为对照。按照MTT法测定波长570nm处的光密度值（OD）。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的OD值减去不加ConA孔的OD值表示。

1.4.4 抗体生成细胞检测：经SRBC免疫的小鼠，致敏后4天处死，取全脾，制成细胞悬液，定容在Hank’S液。按照Jerne改良玻片法，计数溶血空斑数。

1.4.5 血清溶血素测定：经SRBC免疫的小鼠，致敏后4天摘除眼球取血，收集血清，进行血清溶血素的测定。溶血素的量以半数溶血值（HC

50）表示。

1.4.6 小鼠碳廓清实验：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。分别在2min和10min后，从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL0.1%Na2C03溶液中，用酶标仪在600nm波长处测定光密度值（OD），以Na2C03溶液作空白对照。处死小鼠取肝脏、脾脏称重。根据动物体重、肝重和脾重计算吞噬指数a。

1.4.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，间隔1h，颈椎脱臼处死动物，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注射生理盐水2mL，转动小鼠lmin。然后吸出腹腔洗液lmL，平均分滴于2片载玻片上，移至37℃孵箱温育30min。于生理盐水中漂洗，晾干，固定，染色，漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，计算吞噬百分率和吞噬指数。

1.4.8 NK细胞活性测定：实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。处死小鼠无菌取脾，制成脾细胞悬液，按照乳酸脱氢酶（LDH）测定法，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。

1.5  实验数据统计

采用SPSS软件进行统计分析。计量资料采用方差分析，先进行方差齐性检验，方差齐，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；方差不齐时，改用秩和检验进行统计。

2 结果与分析

2.1 对小鼠体重、脏器/体重比值的影响

经口灌胃给予小鼠不同剂量的受试物，各剂量组小鼠体重、体重增重、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值与阴性对照组比较，均无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 对小鼠细胞免疫功能的影响

各剂量组小鼠足跖肿胀度与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01），淋巴细胞增殖能力与阴性对照组比较无统计学差异（P＞0.05），说明受试物小鼠细胞免疫功能实验结果阳性。

表1细胞免疫功能实验结果

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3对小鼠体液免疫功能的影响

中、高剂量组小鼠溶血空斑数、半数溶血值与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05），说明受试物小鼠体液免疫功能实验结果阳性。

表2体液免疫功能实验结果

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05

2.4对小鼠单核一巨噬细胞吞噬功能的影响

各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.01），中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05），各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数与阴性对照组比较无统计学差异（P＞0.05），说明受试物小鼠单核一巨噬细胞吞噬功能实验结果阳性。

表3单核一巨噬细胞吞噬功能实验结果

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.5对小鼠NK细胞活性的影响

各剂量组小鼠NK细胞活性与阴性对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。

表4 NK细胞活性实验结果

3  结论

《保健食品功能检验与评价方法》中“有助于增强免疫力”结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK 细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。本次试验研究中，各剂量组小鼠足跖肿胀度与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。中、高剂量组小鼠溶血空斑数、半数溶血值与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）。中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率与阴性对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。因此可判定以丹参提取物、三七提取物、山楂提取物为原料制成的复方保健食品有助于增强免疫力。

参考文献：

[1]齐晓甜,赵春媛,张家祥,等.中药类保健食品增强免疫力功能评价现状和研究策略[J].中国中药杂志,2019,44(05):875-879. 

[2]毕刚,董成丽,段玉刚,等.丹参对小鼠免疫的影响研究[J].医学美学美容,2019,28(10):19-20.

[3]刘成明,王丽,宁俞媛.三七粉对小鼠免疫调节功能的影响[J].亚太传统医药,2015,11(23):7-8. 

[4]常江,金治萃,高光,等.山楂煎剂对小鼠细胞免疫的影响[J].包头医学院学报,1996,12(04):10-11.

[5]张兴城,高明海,游晓蕾,等.三七丹参片功能学实验研究[J].人参研究,2020,32(01):37-39.

[6]杨铁骊,张小方,潘胜军,等.山楂降脂散对高脂血症患者血脂的影响；附484例患者的病例分析[J].中国中西医结合急救杂志,2017,24(02):166-169.