一例炭疽杆菌分离培养经验介绍

一例炭疽杆菌分离培养经验介绍

胡佩佩  常文英 库亚什柯孜• 排尔哈提

 和田地区疾病预防控制中心

摘要：能否从炭疽患者标本中分离到炭疽芽胞杆菌在很大程度上依赖于病人的情况或疾病的发展期。如果病人已接受过治疗，很可能从水疱液里分离不到炭疽芽胞杆菌，如果病程已超过3～4天，将不容易得到水疱液。通常，血液中很难分离到炭疽芽胞杆菌，除非是菌血症期或濒临死亡的血液标本。此次我们收到皮肤炭疽样本后先进行核酸检测后，检出阳性后，从患者病损渗出液和患者家中土壤里均分离培养到炭疽杆菌，噬菌体实验与青霉素药敏的细菌学鉴定阳性，现将此次成功分离炭疽杆菌经验介绍如下。

关键词：皮肤炭疽，病损处渗出液处，分离培养

  自然土壤中存在多种病原微生物，其中炭疽芽胞杆菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等病原定植土壤后可严重威胁人类的健康。炭疽是一种自然疫源性疾病，其病原菌炭疽芽胞杆菌可形成芽胞，并能在土壤中存活数年且不易被清除，被污染的土壤可引发新一轮的炭疽疫情。

样本采集

能否从炭疽患者标本中分离到炭疽芽胞杆菌在很大程度上依赖于病人的情况或疾病的发展期。如果病人已接受过治疗，很可能从水疱液里分离不到炭疽芽胞杆菌，如果病程已超过3～4天，将不容易得到水疱液。通常，血液中很难分离到炭疽芽胞杆菌，除非是菌血症期或濒临死亡的血液标本。因此对疑似皮肤炭疽病例尽可能在使用抗生素前采集标本，应采集患者伤口的渗出液或水疱液。水疱期内用革兰染色法较易发现炭疽芽胞杆菌，采样时应在无菌操作下穿刺水疱，用无菌棉签沾取水疱液，采样后可用碘酒消毒处理以免细菌扩散；渗出期时，可用玻片直接在皮肤破损处用棉签涂抹渗出物，置无菌容器中。结痂期时，需小心提起外层的焦痂组织，用无菌棉签取焦痂下的组织，可转动棉签2-3s，以保证有足够的标本。皮肤标本应采集2～3份，用于革兰染色镜检、细菌培养或增菌培养。

检测流程

此次样本采集是使用棉签从病损处沾取渗出液至无菌试管内，实验时加入1mL无菌生理盐水充分洗脱棉签，此次在接到疑似皮肤炭疽病例病损处渗出液和血清样本后，我们立即使用中元、卓诚惠生二种炭疽杆菌核酸检测试剂盒行检测为渗出液样本核酸检测阳性，血清样本为阴性，然后将病损渗出液、血液标本直接涂布血平板及营养琼脂平板，37℃过夜培养，同时我们直接用病损渗出液盐水革兰氏染色镜检，从病患家中院内取了3份土壤样本，每份土壤3份各500g，取150g土壤用无菌去离子水没过土壤1~2cm，放置20分钟，取上清液1mL到子弹头里，60℃水浴20分钟，8000转离心10分钟，上清液用于核酸检测，沉淀物划区接种2个培养基，在营养琼脂长势良好。

平板培养形态特征炭疽芽胞杆菌是一种需氧、兼性厌氧的细菌，在简单培养基上容易生长。在营养琼脂上37℃过夜培养后，菌落直径2-3mm，不规则，凸起，无光泽，不透明，灰白色，菌落有卷边不规则，也被称作“狮子头样”。在血琼脂平板上37℃过夜培养后，菌落白色或灰白色，不溶血，直径2mm左右，湿润无光泽。平板上挑选可疑菌落，上述平板在37℃孵育24h后，检查已长出可疑的炭疽芽胞杆菌菌落。炭疽芽胞杆菌菌落的形态为：灰白色、不透明、圆形或表面不规则形状、低倍镜下菌落呈卷发状。

革兰染色和芽胞染色镜检我们直接用病损渗出液盐水革兰氏染色，炭疽芽胞杆菌是革兰染色阳性（蓝紫色），棒状细菌，大小约4μm×1μm，显微镜下呈紫色链状。皮损渗出液涂片时，发现2个或多个细胞排列成较长的链。在细胞中形成透明椭圆形芽胞，不膨出菌体，大多位于菌体中间，有的靠近两极。

细菌学鉴定

将上述分离得到的可疑菌落挑出，划线接种于营养琼脂平板，在划线区内一处滴一滴诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素药敏纸片。37℃孵育24h后，在滴噬菌体处有透明噬菌斑，青霉素药敏纸片周围有明显的抑菌环，便可判定接种物为炭疽芽胞杆菌。

PCR鉴定

将分离培养到的炭疽杆菌刮取半环菌苔制成菌悬液，混匀后用中元提取盒提取核酸，使用2种不同试剂盒进行鉴定均为阳性。使用毒力基因鉴定试剂盒进行毒力基因鉴定。

参考文献

1. 国家致病菌识别网技术规范
2. 炭疽芽胞杆菌感染及传播风险因素监测技术规范

引证文献