高效液相色谱串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐含量的不确定度评定

高效液相色谱串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐含量的不确定度评定

许海林

(肇庆学院食品与制药工程学院，广东  肇庆526061)

摘 要：采用分层建模的方法，本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐含量的测量不确定评定的数学模型，并对数学模型中各不确定度分量的来源进行分析、量化和合成，最后评定不确定度。结果表明标准曲线拟合引入相对标准不确定度分量贡献较大，因此在检测过程中应当减少标准曲线浓度范围选择及标准溶液配制引入的不确定度。

关键词：不确定度；五氯苯酚及其钠盐；水产品；高效液相色谱-质谱联用

五氯苯酚( Pentachlorophenol，PCP)具有杀菌、防腐和杀虫等作用，用于农业、水产畜牧业和木材防蛀等领域，是良好的防霉剂、杀螺剂，作为水产养殖清塘药物被大量使用。然而，PCP及其钠盐的过量使用不仅造成水体污染、养殖环境污染、破坏环境生态平衡；还会在沉积物和生物体内富集作用，具有毒性高、持久性长、难降解等特点[1-2]，由于PCP具有环境雌激素效应，造成中枢神经系统危害，以及内分泌紊乱等毒副作用[3-4]。美国环境保护署（EPA）和欧盟已经将PCP列为致癌物质并限制其使用[5]。2002 年中国农业部公告第193号发布了《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》和 NY 5071-2002《无公害食品 渔用药物使用准则》[6]，明确规定了食品动物生产中禁用PCP及其钠盐。目前对于五氯苯酚含量的分析方法主要有气相色谱法和气相色谱-质谱联用法[7-8]。气相法和气质法都先把提取液在K2CO3溶液净化后，然后加入乙酸酐衍生化后用 GC- ECD 或 GC- MS 测定。该法需引入衍生化反应，存在操作步骤繁琐、效率低、抗干扰能力弱、定性定量不准确、检出限高等问题，影响检测结果。因此，迫切需要建立一种方便、准确、高效的检测方法用于水产品中五氯苯酚的检测工作。高效液相色谱串联质谱法是目前发展起来的一种新的尝试，有些地方自行制定了地方标准并已在实施，例如湖南省市场监督管理局于2020年发布了DB43/T 1833-2020《渔业水体中五氯苯酚的测定 液相色谱-串联质谱法》，这说明该方法测定PCP及其钠盐已经过充分的可行性验证。需要指出的是，新方法的使用需要在实验操作过程控制和提高检验检测结果准确度, 不确定度评价就是一种较好的手段，这也是本文一个重要目的，以便有利于进一步推广该方法的使用。

近年来，我国对水产动物及其制品的质量安全要求更加严格，对检测方法和结果的准确度和可信度提出了更高的要求。国家标准[9-10]规定，检测实验室应开展测量不确定度评定工作，尤其当涉及检测结果临近于临界值时。因此，不确定度是判定测量结果准确度的重要依据[11]，本研究根据 JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与结果表示》[12]和JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》[13]对高效液相色谱串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的不确定度进行了分析与评定，并得到了高效液相色谱串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐的不确定度。

1. 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQD超高效液相色谱质谱联用仪（Waters公司）；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18柱（50mm2.1mm，粒径1.7um，Waters公司）；电子天平（瑞典梅特勒托利多公司）；KQ-500 DB数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Centrisartg-16C高速冷冻离心机（赛多利斯公司）；移液枪（德国Brand公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；MAX固相萃取柱（Waters公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯）；乙酸铵、乙酸（分析纯）；五氯苯酚标准品（纯度大于99%，购于德国Dr Ehrenstorfer公司）；实验用水均为经Milli-Q超纯水器纯化的超纯水。水产品购自当地市场。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液：移取1mL PCP标准品（100 mg/L）至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10 mg/L的PCP标准中间液。

标准工作曲线：用空白基质稀释标准储备液，得到3 ug/L 、5 ug/L、10 ug/L、15 ug/L、20 ug/L的系列基质匹配标准工作液，现配现用。以定量离子的质量色谱图峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液的浓度为横坐标，绘制基质标准工作曲线。

1.2.2 样品溶液制备

样品提取：分别称取样品2 g (精确至0.01g)至50 mL离心管，加入5 mL 1% 乙酸乙腈溶液，超声提取10min，离心5min；残渣重复提取1次，将两次上清液混合均匀，旋蒸至少量体积，待净化。

样品净化：用5mL甲醇和5mL水活化MAX固相萃取柱，将旋蒸液通过固相萃取柱，弃去流出液。分别用5mL 5% 氨水溶液、5mL 甲醇、5mL 2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗净化柱，用真空泵抽干固相萃取柱。用5mL 4% 甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液经氮吹至约1mL，超纯水定容2ml，混匀后过0.22 um微孔有机滤膜，待测定。

1.2.3 超高效液相色谱条件

液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18柱（50mm2.1mm，粒径1.7um）；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5uL；流动相：A为2 mmoL/L乙酸铵0.1%氨水水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0 ~3min，80%~10% A；3~ 5min，10%~ 90% A，5~7min，90% A；运行时间为7min。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源ESI；离子化模式：ESI-；质谱扫描方式：MRM；脱溶剂气温度：600℃；离子传输管温度：500℃；碰撞能量：5ev；锥孔电压：42 v，定量离子对：m/z 265.0/265.0，定性离子对：m/z 262.7/ 262.9、m/z 267.0/267.0、m/z 268.9/268.9。

1.2.5 数学模型建立

试样中五氯苯酚含量以质量分数X计，按以下公式计算：

(1)

式中：X——试样中五氯苯酚及其钠盐（以五氯苯酚计）的含量，ug/kg；

      C——样品溶液中五氯苯酚的含量，ug/L；

      V——提取液体积，mL；

      m——试样质量，g。    

2. 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据测量方法和数学模型，测定结果的不确定度来源可分为以下几个方面：

(1) 标准溶液引入的不确定度，包括标准品的纯度引入的不确定度、标准储备液浓度不确定度、标准溶液配制过程中量器校准和定容体积产生的不确定度以及标准溶液配制过程中温度产生的不确定度等；

(2) 样品溶液的相对不确度，包括随机样品测量引入的不确定度、样品质量引入的不确定度、样品溶液定容体积引入的不确定度、采用最小二乘法拟合标准工作曲线求得试样浓度过程中所引入的不确定度，以及样品处理过程引入的不确定度。

(3) 仪器分析引入的不确定度，包括检测器定量误差引入的不确定度、样品溶液与标准溶液采用同一仪器在相同条件下分析所引入的不确定度等。

2.2 不确定度分量评定

2.2.1标准溶液引入的不确定度

PCP标准溶液不确定来源主要由标准品纯度、标准溶液配制过程、定容体积、温度等产生的不确定度组成。

2.2.1.1 标准品不确定度

PCP标准品（100mg/L）是由Dr. Ehrenstorfer提供，纯度≥99%，其不确定度为u = 0.5 %，此不确定度为扩展不确定度，属正态分布，包含因子k = 2，其标准不确定度为u(Cs)= u/k = 0.25%，因此相对标准不确定度为urel(C标) = 0.25% / 99% =0.0026。

2.2.1.2 标准溶液配制引入的相对标准不确定度

(1) 10ug/mL 标准储备溶液的配制

使用1mL 移液管吸取 PCP标准品（100 mg/L）1mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10 mg/L的PCP标准储备液。根据JJG 646—2006《移液器检定规程》[14]和JJF 196-2006《常用玻璃量具检定规程》[15]规定：A级1mL分度吸量管的最大允许误差为± 0.008mL，取均匀分布，则引入的标准不确定度为u(V1) = 0.008ml/=0.0046 mL；A级单标线 10 ml 容量瓶的容量允许差为 ± 0.020mL，取矩形分布，则引入的标准不确定度为u(V10，体积) = 0.020ml/=0.011 mL；实验室通常温度为25℃± 5℃，定容溶剂甲醇的膨胀系数为1.18 × 10-3/℃，依据矩形分布，温度对体积测量引入的不确定度为u(V10，温度) = 1.18 × 10-3×5×10/=0.034 mL。因此，定容体积引入的相对不确定度为：urel(V10)= = =0.0036

则10 ug/mL 标准储备溶液的配制过程的相对标准不确定度为：

(2) 标准溶液的配制

用量程为1~100 uL 的移液枪准确移取0、3、5、 10、15、20 uL 的标准储备液至10 mL 容量瓶，用基质溶液定容，分别得到0、3、5、 10、15、20 ug/L基质标准溶液。根据移液枪校准证书，实验用移液枪的相对不确定度为 0.3% ，属正态分布，包含因子k = 2，那么相对标准不确定为：urel(V100uL) = u/k = 0.3% /2 = 0.0015 uL。根据JJF 196-2006《常用玻璃量具检定规程》规定：A级单标线10 ml 容量瓶的容量允许差为 ± 0.020mL，取矩形分布，则引入的标准不确定度为u(V10,体积) = 0.020ml/=0.011 mL。实验室通常温度为25℃± 5℃，玻璃量器的体积膨胀受温度影响很小，可忽略不计。然而，温度变化对溶剂的影响不能忽略,定容水溶液的膨胀系数为2.1× 10-4/℃，依据矩形分布，温度对体积测量引入的不确定度为urel(V10

，温度) = 2.1 × 10-4×5×10/=0.0061 mL。由此，定容体积引入的相对不确定度为：urel(V10)= ==0.0013。因此标准工作液配制过程中的相对标准不确定度为：，并可计算出系列标准工作液的相对标准不确定度分别为：0.0014，0.0013，0.0013，0.0013，0.0013，选其最大值作为基质标准溶液的相对不确定度urel(C使)=0.0014。

（3）标准溶液配制过程中量器重复性的不确定度

通过对随机变化过程重复观测得到的估计值，如天平称量重复性、容量瓶定容重复性等引入的不确定度，采用实验标准偏差表示。实验中分别对10ml容量瓶，100uL移液枪的玻璃器重复量取蒸馏水8次，称量计算，重复性不确定度结果分别为：0.016, 0.001。由此可见，配制标准溶液过程中引入的相对标准不确定度为urel(C复)=。

因此，合成标准溶液不确定度由标准品、标准储备液、标准溶液配制（含量具校准、温度变化）以及随机重复测定合成标准的有确定度为：

2.2.2 样品溶液的相对不确定度

PCP样品溶液的不确定度由样品随机检测、重复检测、样品质量、样品定容体积、标准曲线拟合及样品处理过程差异引入的不确定度组成。

2.2.2.1称样引入的相对标准不确定度

实验所用天平经校准最大允许误差± 0.0001 g，称量混合均匀的样品 2.0 g(精确至0.001 g)，按均匀分布计算不确定度为：u(m) = 0.0001/=5.8 × 10-4(g)，urel(m)=0.00058/2 = 0.00029；本文对天平通过10次重复测量，计算得出标准偏差为0.001，则天平重复性引入的不确定度=0.001。本实验称样量为2.000g，由此样品质量引入的相对标准不确定度urel(m) ==0.0010。

2.2.2.2待测样品溶液移液及定容引入的不确定度

样品经提取、净化后定容到2.0mL,根据JJF 196-2006《常用玻璃量具检定规程》规定：A级单标线2.0 mL 容量瓶的容量允许差为 ± 0.015 mL，取矩形分布，则引入的标准不确定度为u(V2,体积) = 0.015mL/=0.0087 mL。实验室通常温度为25℃± 5℃，定容水溶液的膨胀系数为2.1× 10-4/℃，依据矩形分布，温度对体积测量引入的不确定度为u(V2，温度) = 2.1×10-4×5×2mL/=0.0012 mL。因此，定容体积引入的相对不确定度为：

。

2.2.2.3标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度

配制五氯苯酚5个不同浓度的标准工作溶液，分别用液相色谱串联质谱测试3次，得到相应的峰面积A，采用最小二乘法拟合，得到标准工作曲线的线性回归方程，方程的线性相关系数r，结果见表1：

根据以上数据绘制标准曲线，得到的拟合曲线为A=8644.4C –1524.8，其中A为峰面积，C为浓度值，斜率a为8644.4，截距b为-1524.8。相关系数r= 0.991。同时，对加标样品进行重复6次测定，加标量为5.0 ug/L，其结果分别为：4.35、4.52、4.76、3.87、4.29、3.89 ug/kg，平均值为4.28 ug/kg。

利用不确定计算公式：

标准溶液的平均浓度为：，

标准溶液浓度残差的平方和：

标准溶液峰面积残差的标准差：

对样品溶液进行3次测定，P=3，n=5×3=15。根据峰面积用标准工作曲线的线性回归方程求得的平均浓度C为 4.28 ug/L，则由最小二乘法拟合标准工作曲线引入的标准不确定度为：

，

由最小二乘法拟合标准工作曲线引入的相对标准不确定度为：

，

校正过程引入的不确定度为：

。

2.2.2.4样品处理操作过程差异的不确定度

样品处理过程中，样品的均匀性、前处理步骤(包含提取、净化及定容等) 以及人机操作都会产生不确定度，本文以 6 次加标回收实验的相关数据(添加量为 5μg /L)进行计算。5 次回收率测定结果分别为：87.0% 、90.4% 、95.2% 、77.4% 、85.8%和 77.8%，平均回收率 R =85.6% ，标准偏差 S = 0.070 ，相对不确定度为：u(R) = S = 0.070。标准不确定度为：urel(R) = u(R)/R = 0.070/0.856 =0.082。

因此，合成样品溶液不确定度由样品称样、样品溶液称取及定容、标准曲线拟合以及样品处理过程中引入的不确定度为：

。

2.2.3 仪器定量分析引入的不确定度

PCP浓度与其峰面积成正比，则峰面积大小直接影响结果准确度，峰面积的不确定度主要由进样体积和测定过程随机因素引入，以及质谱检测器等因素决定。对于样品重复性进样及重复测量峰面积引入的不确定度，由于实验采用自动进样器、工作站自动积分，可忽略由其引入的不确定度。试样检测中峰面积引入的不确定度主要由质谱检测器校准引起，根据校准证书提供:U = 1% ，k = 2，则色谱峰面积引入的相对不确定度为: urel(A) = 1% /2 = 0.0050。

测试过程随机因素引起的相对标准不确定度，由2.2.2.4节中样品溶液6次重复测定结果可得，测得浓度的相对标准偏差s=0.052，因此液相色谱串联质谱法测定PCP过程中随机因素引入的相对标准不确定度为0.052。由于在测定过程中，需要对标准溶液和样品溶液进行两次测定，所以气相色谱测定过程中的相对标准不确定度为0.052/2=0.029。由此可得，仪器引入的相对标准不确定度：。

2.3 计算合成不确定度

因各不确定度分量相互独立，故水产品中PCP及钠盐残留量测定结果的相对标准不确定度为：

，

其中C为平均浓度， 4.28 ug/L。由此可得合成标准不确定度为：u(C) = C × urel(C) = 4.28 × 0.098 = 0.42 ug/kg。

2.4 扩展不确定度及报告不确定度

在置信概率为95%，包含因子k =2，则u95 = k × u(C) = 2 × 0.42 = 0.84 ug/kg；故本文水产品中PCP及钠盐残留量测定结果为：C = 4.28 ± 0.84 ug/kg。

3 结论

本研究从标准品纯度、标准储备液、标准系列溶液的配制、样品称量、随机和重复测定、样品处理以及从仪器等方面对液相色谱串联质谱法测定水产品中PCP残留量的方法不确定度进行了分析，结果PCP的扩展不确定度为4.28 ± 0.84 ug/kg，其中样品处理对不确定度的贡献最大，标准曲线拟合引入的不确定度最大，因此在检测过程中应根据测定对象的量值选择合适的包含被测样品浓度的标准曲线浓度范围，并尽量提高实验结果的平行性，以保证结果的准确可靠。

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