蜗牛酶水解金丝桃苷制备槲皮素的酶解工艺研究

蜗牛酶水解金丝桃苷制备槲皮素的酶解工艺研究

崔施展，张菊，王明雪，郑萱，吕允珂，刘灵娣，贾东升（通讯作者）

河北省农林科学院经济作物研究所，河北石家庄，050051

摘要：目的 研究蜗牛酶水解金丝桃苷制备槲皮素的酶解工艺。方法 以槲皮素转化率为考察指标，采用单因素分别考察不同蜗牛酶酶解温度、酶解时间、酶解pH值对金丝桃苷水解过程的影响。结果 蜗牛酶酶解温度30℃、酶解时间48 h、酶解pH值5.5条件下，蜗牛酶对金丝桃苷的转化效率最高，该条件下槲皮素的得率达到89.67%。结论 该方法简便、可行，可用于金丝桃苷水解制备槲皮素的研究。

关键词：蜗牛酶、金丝桃苷、槲皮素

槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、降低毛细血管脆性、增强免疫力等多种功效，近年来，在癌症的预防与治疗方面槲皮素也被认为具有重要作用[1]。槲皮素分布广泛，可以存在于植物的花、叶、果实等多个部位，但是多数槲皮素均以苷的形式存在，如芦丁、金丝桃苷、槲皮苷等，需要通过分离纯化、酶解反应、酸水解等手段制备，其中以酶解法最为实用[2]。研究发现，生物酶具有高度的专一性和特异性，其反应条件通常较温和、酶解产物类型可控、操作工艺简单、设备要求较低，在新型或稀有化合物的制备中具有重要地位，目前已被广泛应用于生物、医药、食品等各个领域[3]。

蜗牛酶是由多种酶混合成的一组酶，可以用于脱除β-苷键、α-苷键等，具有较强的水解能力，前期研究发现，桑叶黄酮酶解后山奈酚-3-半乳糖苷-6''-鼠李糖-3'''-鼠李糖苷含量明显降低，而山柰酚含量发生明显升高，可见蜗牛酶对半乳糖苷键也有脱除作用，故本研究采用蜗牛酶水解金丝桃苷，以槲皮素的转化率为考核标准，建立蜗牛酶水解糖苷键工艺，制备槲皮素。

1 实验材料

1.1 实验仪器

2695-2998高效液相色谱仪(美国Waters)；HNY-1102C立式光照恒温摇床(上海捷呈实验仪器有限公司)；PTX-FA300S分析天平（万分之一，上海实润实业有限公司）。

1.2 药品与试剂

金丝桃苷对照品（驻马店馨星生化公司）；槲皮素对照品（河北省药品检验所）。蜗牛酶(翌圣生物科技（上海）股份有限公司)；甲醇(色谱纯，青岛天泽生物技术有限公司)；磷酸(色谱纯，上海北诺生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 槲皮素含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱Waters C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)(25∶75)，进样量10μL，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长360 nm。

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取槲皮素对照品4 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，制成质量浓度为400 μg/mL的贮备液，备用。

2.1.3 对照曲线配制

分别精密量取上述贮备液0.1、0.2、0.5、1、2、4mL 置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，配制成浓度约为4、8、20、40、80、160 μg/mL的标准曲线工作溶液。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得到槲皮素回归方程为Y= 63.274X+319.472，(r=0.99986)，槲皮素在37.28～1462ng范围内呈良好线性关系。

2.2 酶解参数优化

以槲皮素转化率为考察指标，采用单因素考察不同蜗牛酶酶解温度、酶解时间、酶解pH值对槲皮素转化率的影响。

槲皮素转化率=（酶解后槲皮素特征吸收峰峰面积-酶解前槲皮素特征吸收峰峰面积)/酶解前槲皮素特征吸收峰峰面积×100%）

2.2.1 酶解温度考察

设定酶解时间48 h、酶解pH值5.5、酶添加量2500 U/g，分别按照“2.2.1”方法测定酶解温度为10°C、20°C、30°C、40°C、50°C时槲皮素的含量，并计算槲皮素转化率水平。

2.2.2 酶解时间考察

设定酶解温度30°C、酶解pH值5.5、酶添加量2500 U/g，分别分别按照“2.2.1”方法测定酶解时间为24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时槲皮素的含量，并计算槲皮素转化率水平。

2.2.3 酶解pH值考察

设定酶解温度30°C、酶解时间48 h、酶添加量2500 U/g，分别按照“2.2.1”方法测定酶解pH值为4.5、5、5.5、6、6.5时槲皮素的含量，并计算槲皮素转化率水平。

3 结果

3.1 酶解温度考察

酶解温度升高槲皮素转化率逐渐升高，酶解温度为30°C 时槲皮素转化率水平达到最高值，高于30°C后，随着温度的升高黄酮转化率降低，因此酶解温度选择30°C，见表1。

3.2 酶解时间考察

酶解时间延长，槲皮素的转化率升高，当酶解时间达到48 h后，转化率趋于稳定不再发生显著变化，因此酶解时间选择48 h更为合适，见表1。

3.3 酶解pH值考察

随着酶解pH值的不断升高，槲皮素的转化率呈现先升高后降低的趋势，当酶解pH值达到5.5时转化率达到最大值，因此将酶解pH值确定为5.5，见表1。

表1 不同单因素水平对槲皮素转化率的影响

4 讨论

糖苷键断裂有酸、碱催化法及酶法等，其中酶法脱苷具有专一性强，反应温和、无污染等特点，是脱除糖苷键最为常见的方法之一[4]。已有研究发现采用蜗牛酶可以水解淫羊藿苷中的3-位鼠李糖苷和7位葡萄糖苷[5]，获得淫羊藿苷元。此外，蜗牛酶是一组复杂的混合酶，已有研究发现，蜗牛酶对α-苷键、β-苷键等的水解能力较强[6]，因此本研究采用蜗牛酶水解金丝桃苷制备槲皮素，其最优工艺为酶解温30°C、酶解时间48 h、酶解pH值5.5，在此条件下槲皮素的转化率为89.67%，该酶解工艺简便合理，可用于槲皮素的制备。

参考文献：

[1] 蔡剑辉,任约翰,厉金雷,等.槲皮素调控白细胞介素-6/信号转导及转录激活蛋白3信号通路在结肠炎性相关结肠癌小鼠模型的机制研究[J].中国药物与临床,2020,20(6):896-899.

[2] 翟广玉,朱鹏,刘娜,等.芦丁水解制备槲皮素的实验条件比较研究[J].化学与粘合,2009,31(02):33-36.

[3] 李清筱.纤维素酶辅助提取马齿苋总黄酮工艺优化及抑菌分析研究[J].中国食品添加剂,2024,35(04):131-139.

[4] 郑美瑜,陆胜民,陈剑兵,等.糖苷酶对橙皮苷和柚皮苷的酶解作用研究[J].中国食品学报, 2010, 10 (04): 141-146. 

[5] 贾东升，贾晓斌，薛璟，等.蜗牛酶转化淫羊藿苷制备淫羊藿苷元的研究[J].中国中药杂志,2010,35(07):857-860.

[6]Christoph K, Jakob S, Heidi H.Snailase: A Promising Tool for the Enzymatic Hydrolysis of Flavonoid Glycosides From Plant Extracts.[J].Frontiers in plant science, 2022, 13889184-889184.

基金项目：河北省农林科学院科技创新专项课题，道地药材连翘、酸枣新品种选育及栽培加工关键技术研究（2022KJCXZX-JZS-4）。

作者简介：崔施展，男，研究生，研究方向：天然产物功效评价及机制研究。

通讯作者：贾东升，男，博士，副研究员，研究方向：中药资源综合利用与功能食品研究。