内毒素微量法影响因素试验

内毒素微量法影响因素试验

刘瑶  李昕睿 

天津赛诺制药有限公司

摘要：在进行微量法的检测时，存在诸多检验细节，其中放置时间和标准曲线可能影响检测结果。实验表明，抗增液溶解鲎试剂后应在2分钟之内使用，鲎试剂与样品溶液混合后，应尽快上机检测，放置时间越长，对结果的影响越大，内毒素含量越高，对结果的影响越大。不同标准曲线对检测结果的影响较小。近年来由于鲎资源日益紧缺，凝胶法使用的鲎试剂量较大，微量动态显色法所使用的鲎试剂量为凝胶法的1/4，故尝试使用微量动态显色法替代传统凝胶法检测内毒素。为保证检测结果的准确性，检测过程中诸多限制及影响因素应尤其注意。

关键词：微量动态显色法、时间、细菌内毒素、鲎试剂

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖（LPS），为革兰氏阴性菌的主要抗原及致病性成分，而其生物活性和致病毒力则主要源于化学结构中的类脂A。细菌内毒素可导致机体持续发热，影响细胞代谢，引发血管内凝血，并导致革兰氏阴性菌感染者发生败血症和脓毒血症。细菌内毒素在革兰氏阴性菌的生长和消亡中会不断从其外膜上脱落并释放。细菌内毒素普遍存在于水源、食品和各种环境中，尤其是存在于感染者体内，对人类和畜禽等的健康具有潜在危害[1]。故在所有注射剂产品中均应进行检测。

根据《中国药典》2020年版标准，细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法,具有定量检测、简便、 快捷、灵敏度高等优点[2]。在《细菌内毒素检查法应用指导原则》中也提到了C因子法，也是进行内毒素检测的方法之一，未纳入正式检验方法中。近年来由于鲎资源日益紧缺[3]，凝胶法使用的鲎试剂量较大，微量鲎试剂法是国内为了应对鲎资源减少而研发的一类方法，目前已经出现微量凝胶法和微量动态显色法[7]。微量动态显色法所使用的鲎试剂量为凝胶法的1/4，故尝试使用此方法替代传统凝胶法检测内毒素。由于实验试剂都是微量试剂，且实验过程中影响结果的因素较多，优先探讨实验过程中各阶段时间对结果的影响。为保证检测结果的准确性，检测过程中诸多限制及影响因素应尤其注意，包括样品干扰、使用试剂耗材、操作环境、振荡时间等。

本实验主要探究以下三个方面的内容：标准曲线点数、鲎试剂加入后上机时间和抗增液溶解鲎试剂时间对微量动态显色法检测细菌内毒素含量的影响。所用样品来自天津赛诺制药有限公司，在进行此实验前已获得样品的最大有效稀释倍数并排除干扰。

1. 材料与方法

1.1试剂与材料

细菌内毒素检查用水（BET水，内毒素含量< 0.005 EU/mL，批号2111250，规格5 mL/瓶）、细菌内毒素工作标准品（批号2301041，规格10 EU/支）、微量显色鲎试剂（批号 2111030，规格 0.35 mL/支）、抗增液（批号2103230，规格0.6 mL/支）均购自湛江安度斯生物有限公司。

微量加样器（德国艾本德公司）、无热原15 mL离心管（赛默飞世尔科技有限公司）、无菌无热原一次性枪头（湛江安度斯生物有限公司），样品6批均来自天津赛诺制药有限公司。

1.2仪器设备

Multiskan ET酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）、旋涡混合仪（赛默飞世尔科技有限公司）

1.3试验方法

1.3.1　标准溶液配制 取细菌内毒素标准品1支，加入1.0 mL BET检查用水，充分旋涡混匀15 min溶解，得到10 EU/mL的细菌内毒素标准溶液，使用BET检查用水逐级稀释，旋涡混匀30 s，配制成所需的系列标准曲线溶液。

1.3.2　样品测定 细菌内毒素测定仪的工作参数设置为：测定波长 405 nm，测定温度 37 ℃。根据总样品量取一定量的鲎试剂，每支加入0.35mL抗增液，涡旋 30 s，将溶解的鲎试剂混合在一起并轻轻混匀，即配即用。

2. 结果与分析

本次实验均按照《中国药典》2020年版要求进行检测，回收率均在50-200%范围内，不列入数据统计范围内，以下为实验设计：

2.1标准曲线点的影响实验：

标准曲线1:2,0.2,0.02；

标准曲线2：2，0.5，0.1，0.02；

标准曲线3：2，0.5，0.125，0.0625，0.02

三次实验，使用不同的标准曲线检测（应符合《中国药典》2020年版标准）分别检测3批样品，进行平行检测。

结果统计如下：

由上表可以看出，不同的标准曲线对同一样品检测结果影响不大，均可用于微量法实验的检测。

2.2抗增液溶解鲎试剂时间的影响。

实验方法：在同一个96孔板上使用2，0.2，0.02的标准曲线，加抗增液溶解的鲎试剂，分别在1min-10min加鲎试剂，使用同批原料药样品进行检测，结果统计如下：

由上表可以看出，最好是能在2分钟之内完成鲎试剂加入样品的操作，3-10分钟溶解的鲎试剂检测样品数据稳定，根据不同的检测准确性要求可进行评估是否能用于微量法实验的检测。

2.3鲎试剂加入后上机时间的影响。

实验方法1：在同一个96孔板上使用2，0.2，0.02的标准曲线，加抗增液溶解的鲎试剂，分别在0min/2min/4min加鲎试剂，使用同样的3批样品样品进行检测，在4min时先开始加阴性对照及标准品，再加4min的样品，结果统计如下：

由上表可以看出，样品与鲎试剂混合后，放置时间越长，对样品检测结果影响越大，呈现逐步下降的趋势。再进行30s内样品加入后放置时间的影响检测，具体如下：

实验方法2：在同一个96孔板上使用2，0.2，0.02的标准曲线，加抗增液溶解的鲎试剂，分别在0/5/10/15/20/25/30s加溶解后的鲎试剂，使用同样的3批样品样品进行检测，在30s时开始加阴性对照及标准品，再加30s的样品，结果统计如下：

由上表可以看出，在鲎试剂与样品混合完成后，需尽快加入上机检测。内毒素含量越大，放置时间对结果的影响越大。

3讨论与结论

以上实验分别对3点、4点、5点标准曲线检测结果、抗增液溶解鲎试剂时间、鲎试剂加入后上机时间等项目检测结果进行对比，得出标准曲线点数对内毒素检测结果影响较小，抗增液溶解鲎试剂后应在2分钟之内使用，鲎试剂与样品混合后应尽快上机检测，放置时间越长，对结果的影响越大，样品本身内毒素含量越高，对结果的影响越大。除以上实验项目外，仍存在诸多影响因素干扰实验结果的准确性，在此不做说明。

微量动态显色法作为一种定量检测内毒素的方法，可作为凝胶法的补充方法进行日常的内毒素检测。各方法间由于试剂的影响会存在细微差异，随着时代的进步和新方法的不断探索，我们定能在日后保证检验结果准确的前提下使用更加安全、准确、有效的检验方法进行内毒素的检测。

参考文献

[1]林钦恒，伍玲燕，黄璇莹，等.动态浊度法定量检测猫粮中细菌内毒素含量的研究[J].饲料研究, 2024,（03): 122-126.

[2]陈晓佳,林金海,丁友玲.动态浊度法检测细菌内毒素方法的改进[J].上海医药, 2023, 44(21): 62-65.

[3]王娅宁, 高龙.细菌内毒素检查法研究进展 [J]. 现代盐化工, 2019,46(5): 59-60.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2020.

[5]肖婧薇,王文佳,何华红,等.大豆磷脂酰胆碱细菌内毒素检查方法考察[J].中国药业,2019,28(16):41-44.

[6]颉晓勇,钟金香,关杰耀, 等. 基于鲎试剂需求的中国鲎资源保护的迫切性研究[J]. 中国渔业经济, 2021, 39(2): 109-116.

[7]裴宇盛, 陈晨, 耿颖, 高华, 蔡彤. 微量动态显色法与动态显色法的等效性评价[J]. 中国药理学通报, 2022, 38(7): 1107-1109.