注射用头孢呋辛钠中的聚合物杂质分析

注射用头孢呋辛钠中的聚合物杂质分析

1吴清苗 2王绥和

（海南海药股份有限公司 海南省海口市 570100）

摘要： 聚合物杂质研究一直是β-内酰胺类和头孢菌素类抗生素质量控制中的重要内容。以头孢呋辛钠为例，采用质谱方法分析注射用头孢呋辛钠中的聚合物，结果检测到1个聚合物杂质峰，并对聚合物的可能结构进行了推测。通过对葡聚糖凝胶色谱法、高效凝胶色谱法和头孢呋辛钠药典方法的有关物质方法（反相高效液相色谱法）对比研究，证明反相高效液相色谱法比葡聚糖凝胶色谱法和高效凝胶色谱法更适于聚合物杂质质控。最终在药典有关物质方法的基础上建立了注射用头孢呋辛钠的聚合物检测方法，并进行方法验证。

关键词：头孢呋辛钠；聚合物杂质；高效液相色谱；葡聚糖凝胶色谱；高效凝胶色谱。

聚合物研究是头孢菌素类抗生素药品质量研究的重要内容, 对聚合物的精确测量和结构分析是聚合物研究的难点。目前, 已有聚合物结构研究报道的头孢菌素品种有头孢噻肟钠[1]、头孢拉定[2]、头孢唑林[3]、头孢唑肟钠[4], 其中头孢噻肟二聚体结构已被《美国药典》收载并采用有关物质方法作为已知杂质进行限度控制，头孢唑肟二聚体结构已被《中国药典》收载并采用有关物质方法作为已知杂质进行限度控制。

头孢呋辛钠为第二代头孢菌素类抗生素，通过抑制细胞壁的生物合成而达到杀菌作用，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有作用。由于其抗菌谱广、抗菌活性强，故为第二代头孢菌素国内目前应用较多的品种。目前, 除《中国药典》 (2020年版) (简称ChP 2020) 外, 其他现行版官方药典均未对头孢呋辛钠中的聚合物杂质进行控制。ChP 2020采用葡聚糖凝胶色谱法(简称G10方法) 控制头孢呋辛钠中的聚合物。G10凝胶色谱法是中国药典中收载的控制抗生素类药品中聚合物杂质的普遍方法, 但该法对聚合物杂质检测的专属性及定量准确性较差，后来逐渐被高效凝胶色谱法(固定相是TSKgel G2000SW, 简称TSK方法) 和反相高效液相色谱法(RP-HPLC) 所取代。目前未见采用HPLC法对头孢呋辛钠中单个聚合物杂质进行质控，因此, 有必要针对头孢呋辛钠中的聚合物情况选择最合理的聚合物质控方法。

1. 材料与方法

1.1仪器

高效液相色谱仪：waters e2695型液相色谱系统(配二极管阵列检测器)。

1.2样品

注射用头孢呋辛钠，来源于海口市制药厂有限公司。

1.3高效液相色谱法（HPLC方法）

色谱柱为月旭的Ultimate XB-C8 (250 mm×4.6 mm, 5μm)，流动相A为醋酸盐缓冲液(取醋酸钠0.68g，冰醋酸5.8g，加水稀释成1000ml，用冰醋酸调节pH值至3.4)，流动相B为乙腈，流速为1.5ml·min-1，检测波长为273nm，柱温为30 ℃，进样量为20μl。梯度洗脱程序：在0、40、50、51和55min时，流动相A的比例分别是95%、80%、60%、95%和95%。

1.4高效液相色谱法（G10方法）

色谱柱为依利特的凝胶色谱柱Sephadex-G10(10.0mm×300mm，40-120μm)，流动相为pH7.0的0.025mol·L-1磷酸盐缓冲液[0.025mol·L-1磷酸氢二钠溶液-0.025mol·L-1磷酸二氢钠溶液(61∶39)]，流速为1.5ml·min-1, 检测波长为254nm。

1.5高效凝胶色谱法（TSK方法）

色谱柱为TSKgel G2000SWxl (TOSOH, 7.8mmI.D×300mm, 5μm)，流动相为磷酸盐缓冲液(pH 7.0) [0.005mol·L-1磷酸氢二钠溶液-0.005mol·L-1磷酸二氢钠溶液(61∶39)]-乙腈(95∶5)，流速为0.6ml·min-1，检测波长为254nm，柱温为30 ℃，进样量为20μl。

1.6质谱方法（2D-LC-MS方法）

色谱柱为月旭的Ultimate XB-C8 (250 mm×4.6 mm, 5μm)，流动相A为0.1%甲酸溶液(用稀氨水调节pH值至3.4)，流动相B为乙腈，流速为1.5ml·min-1，检测波长为273nm，柱温为30 ℃，进样量为20μl。梯度洗脱程序：在0、40、50、70和85min时，流动相A的比例分别是95%、80%、60%、95%和95%。

1.7溶液配制

供试品溶液：取注射用头孢呋辛钠适量，用水稀释制成每ml含头孢呋辛0.5mg的溶液。

分离度溶液：取杂质A、B、C、E、F、G、H、I和头孢呋辛对照品适量，用水稀释制成每ml含各杂质0.05mg和头孢呋辛0.5mg的混合溶液，室温放置6h。

系统适用性溶液：取注射用头孢呋辛钠适量，用水稀释制成每ml含头孢呋辛2mg的溶液，置水浴中放置60分钟，放冷，即得。

2. 结果
   1. HPLC法的分析结果

采用HPLC色谱分析头孢呋辛钠，色谱图见图1，头孢呋辛各杂质的结构见图2。

1：杂质I；2：杂质K；3：杂质A；4：头孢呋辛；5：杂质F；6：杂质E；

7：杂质C；8：杂质B；9：杂质H；10：杂质G；11：聚合物1

图1 供试品溶液（A）和分离度溶液（B）典型色谱图

图2 头孢呋辛的杂质结构式

2.2.2D-LC-MS的分析结果

根据HPLC系统调整流动相，采用柱切换2D-LC-MS法分析主峰后的各色谱峰，最终确认了图1中的色谱峰11为聚合物，其[M+H]+离子为m/z744.1221。二级碎片中信号响应较高的m/z364.0466、m/z336.0361，可能的MS2裂解图和裂解途径见图3，可能的降解机理见图4；其他色谱峰均不是聚合物。

图3 聚合物1[M+H]+推测的结构及MS2裂解途径

图4 聚合物1推测的降解机理

2.3 HPLC法分离聚合物杂质的方法验证

（1）专属性

采用头孢呋辛钠中国药典有关物质方法中的系统适用性溶液配制方法，提高配制浓度和水浴破坏时间对专属性进行考察。由图 1可见，聚合物杂质峰与相邻色谱峰分离良好，因此本法可有效分析头孢呋辛聚合物，专属性良好。

（2）检测限和定量限

以头孢呋辛钠对照品配制一系列的溶液进行考察，得到聚合物1检测限和定量限分别为2.2ng和4ng，满足检测要求。

（3）耐用性

考察在不同色谱条件下头孢呋辛聚合物1的分离情况。流动相pH值分别为3.3、3.4、3.5时，头孢呋辛聚合物和相邻杂质峰间分离度均大于1.5。柱温分别为28、30、32时，头孢呋辛聚合物和相邻杂质峰间分离度均大于1.5。流动相A中醋酸钠的用量分别为0.61g、0.68g、0.75g时，头孢呋辛聚合物和相邻杂质峰间分离度均大于1.5。色谱柱分别为YMC Pack Pro C18、Agilent Eclipse Plus C18和Hypersil BDS C18（型号为250 mm×4.6 mm, 5μm）时，头孢呋辛聚合物和相邻杂质峰间分离度均大于1.5。

2.4 聚合物测定结果

分别采用葡聚糖凝胶色谱法（G10法）、高效凝胶色谱法（TSK法）和头孢呋辛钠药典方法的有关物质方法（RP-HPLC法）对注射用头孢呋辛钠进行聚合物测定，按主成分自身对照法（1%）进行计算，结果显示，注射用头孢呋辛钠的聚合物含量分别为0.1%、0.5%和0.05%，可见高效凝胶色谱法（TSK法）除可检出聚合物杂质外，还包括许多小分子杂质。

3 结论

选择适宜的聚合物质控方法是聚合物研究的重点内容。本文还对头孢呋辛聚合物检测的G10方法和TSK方法进行了考察，结果显示，G10方法和TSK方法中的各色谱峰均可在HPLC系统中检测到，而且在HPLC系统中能洗脱所有潜在的杂质，包括聚合物杂质，说明HPLC系统的分离效果和检测专属性优于G10法和TSK方法，可建立以聚合物1为指标聚合物控制的高效液相色谱法对头孢呋辛聚合物杂质进行质控。

参考文献

[1] 李进,姚尚辰,等. 头孢噻肟钠原料的聚合物杂质分析[J]. 中国抗生素杂志，2020，45:883-892

[2] 李进,张培培,等. 头孢拉定原料及制剂的聚合物杂质分析[J]. 中国抗生素杂志，2019，44（4）:362-369.

[3] 李进,张培培,等. 注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠的聚合物杂质分析[J]. 药物分析杂志，2019，39(7):1279-1294.

[4] 张夏,李进,等. 头孢唑林钠原料及制剂的聚合物杂质研究[J]. 药学学报，2021，56(6):1677-1682.

[5] 头孢唑肟钠质量标准. 中华人民共和国药典，2020年二部.