HPLC法测定注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠中的依地酸二钠含量

HPLC法测定注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠中的依地酸二钠含量

范学杠

（海南蓝康医药生物技术有限公司 海南海口570311）

摘要  目的 建立高效液相色谱法测定注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠中的依地酸二钠含量。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶（InertSustain C18，4.6 mm×150mm，5μm或效能相当的色谱柱）为填充剂，以含四丁基氯化铵的醋酸盐缓冲液（取四丁基氯化铵2.4g和醋酸钠4g，加水950ml溶解，加冰醋酸5.0ml，用1mol/L枸橼酸溶液调节pH值至4.0，再加水稀释至1000ml）为流动相A；以乙腈-流动相A（60:40）为流动相B；进样量为20µl；按梯度方法洗脱；检测波长为350nm。结果：主成分峰与相邻色谱峰达到基线分离。依地酸二钠溶液浓度在12.29～28.67µg/ml范围内，线性回归方程为y=5.6109x-0.2521，相关系数为0.9997，各点浓度 Y轴截距偏差在0.16%～0.37%之间，均小于2.0%；中间精密度试验含量平均值为0.968%，RSD为1.4%（n=12）；回收率平均值为99.2%，RSD为1.2%（n=9）；三批样品检测结果均在0.90~1.10mg范围内。结论：方法学验证结果表明，本法可作为注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠中依地酸二钠质量控制的方法。

关键词 高效液相色谱法 哌拉西林钠他唑巴坦钠 依地酸二钠、含量

注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠是由哌拉西林钠与他唑巴坦钠以8：1的配比组成的一种加酶抑制剂复方制剂。哌拉西林钠属于广谱青霉素类抗菌药物，其作用机制是通过影响细菌细胞壁的合成，从而起到杀菌作用；他唑巴坦钠是一种β-内酰胺酶抑制剂，可抑制β-内酰胺酶，保护哌拉西林钠不被水解，增强了哌拉西林钠的抗菌活性，拓宽了抗菌谱[1]。依地酸二钠（EDTA-2Na）在药物制剂、化妆品和食品中被用作螯合剂，它与碱土金属和重金属离子形成稳定的水溶性络合物（螯合剂）[2-7]。依地酸二钠为注射用用哌拉西林钠他唑巴坦钠中重要的辅料之一，因此，依地酸二钠作为质量标准中关键控制指标。

1.仪器及材料

1.1.仪器  1260Ⅱ型高效液相色谱仪（安捷伦）、CPA225D型十万分之一电子天平（赛多利斯）、FE28型pH计（梅特勒-托利多）、KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2.材料  四丁基氯化铵（阿拉丁）、醋酸钠（广州化学试剂厂）、冰醋酸（广州化学试剂厂）、枸橼酸（阿拉丁） 、硫酸铁（阿拉丁）、乙腈，色谱纯（西陇化工）、乙二胺四乙酸二钠（二水）（依地酸二钠）（Sigma）、注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠[4.5g（C23H27N5O7S4.0g与C10H12N4O5S0.5g）]（海南蓝康医药生物技术有限公司）。

2.试验方法

2.1.溶液制备  取硫酸铁0.2g，精密称定，加流动相A溶解并稀释至1000ml，作为溶剂；取依地酸二钠对照品溶液适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含20µg的溶液，摇匀，作为对照品溶液；取本品2瓶内容物，加溶剂适量分别溶解，并转移至同一100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶（InertSustain C18，4.6 mm×150mm，5μm或效能相当的色谱柱）为填充剂，以含四丁基氯化铵的醋酸盐缓冲液（取四丁基氯化铵2.4g和醋酸钠4g，加水950ml溶解，加冰醋酸5.0ml，用1mol/L枸橼酸溶液调节pH值至4.0，再加水稀释至1000ml）为流动相A；以乙腈-流动相A（60:40）为流动相B；进样量为20µl；按下表进行梯度洗脱；检测波长为350nm。

 梯度洗脱程序

3.验证结果及讨论

3.1.线性关系与范围取依地酸二钠对照品溶液适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含100µg的溶液，摇匀，分别精密量取对照品母液3、4、5、6、7ml，分别置于25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，系列对照品溶液。（相当于限度的60%、80%、100%、120%、140%）

取上述溶液按“2.2.”项色谱条件进行测定。依地酸二钠在12.29～28.67µg/ml浓度范围内，线性回归方程为y=5.6109x-0.2521，相关系数为0.9997，各点浓度 Y轴截距偏差在0.16%～0.37%之间，均小于2.0%，本品对照品溶液线性关系良好。

3.2.精密度试验取同一批号的样品，在不同时间，由两位试验员在两台仪器上进行检测。按上述“2.1”项方法制备溶液，按“2.2”项试验条件进行测定，试验员1测定依地酸二钠含量平均值为0.965%，RSD为1.2%（n=6）；试验员2测定依地酸二钠含量平均值为

0.970%，RSD为1.6%（n=6）；两位试验员测定的含量平均值为0.968%，RSD为1.4%（n=12），中间精密度试验满足测定要求。

3.3.溶液稳定性试验按上述“2.1”项方法制备供试品溶液及对照品溶液，按“2.2”项试验条件进行测定。制备好的供试品溶液及对照品溶液，在室温条件下放置12小时，并分别在0、2、4、6、8、10、12小时取样分析。结果显示，依地酸二钠对照品溶液在室温条件下放置12小时，主成分峰面积峰面积的RSD为1.5%，小于2.0%，溶液稳定性良好。供试品溶液在室温条件下放置，溶液在放置20分钟后，有沉淀析出。因此，供试品溶液应临用新制。

3.4.准确度试验按制剂处方比例，制备阴性储备液（每ml约含哌拉西林320mg和他唑巴坦40mg的溶液），作为阴性储备液。精密称取对照品适量，加溶剂溶解并稀释制成约含80µg/ml的溶液，作为对照品母液。80%回收率溶液：精密量取对照品母液4ml，置于20ml容量瓶中，再加入阴性储备液5ml，加流动相稀释至刻度，摇匀。100%回收率溶液：精密量取对照品母液5ml，置于20ml容量瓶中，再加入阴性储备液5ml，加流动相稀释至刻度，摇匀。120%回收率溶液：精密量取对照品母液6ml，置于20ml容量瓶中，再加入阴性储备液5ml，加流动相稀释至刻度，摇匀。（回收率溶液各同法配制3份）。按上述“2.1”项方法制备对照品溶液，按“2.2”项试验条件进行测定。结果显示，回收率平均值为99.2%，RSD为1.2%（n=9）。

3.5.耐用性试验以考察本品测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。因此，对液相色谱法中典型的变动因素进行试验。其变动因素如下：柱温（28℃、32℃）、流速（0.9ml/min、1.1ml/min）、流动相A pH值(3.8、4.2)。按上述“2.1”项方法制备供试品溶液及对照品溶液，按“2.2”项试验条件进行测定。结果显示，各变动条件下的测定结果与拟定条件下比较，在99.1%～101.5%范围内，均在98.0%～102.0%范围内。

3.6.样品测定 取三批样品，按上述“2.1”项方法制备供试品溶液及对照品溶液，按“2.2”项试验条件进行测定。按平均装量计算，平均每瓶含依地酸二钠（C10H14N2O8Na2）应为0.90~1.10mg范围内，实测三批样品分别为0.98mg/瓶、1.01mg/瓶、1.03mg/瓶，RSD均小于0.8%，测定结果符合要求。

3.7.讨论

3.7.1.波长选择，对照品溶液在200nm～400nm波长范围内进行紫外光谱扫描，在294.4nm波长有最大吸收峰，参照注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠进口注册标准JX20100198中依地酸二钠的检查项的检测波长扫描结果，将本品依地酸二钠的测定项的检测波长确定为350nm。

3.7.2.耐用性试验，在拟定色谱条件下进行色谱条件微小改变测定，依地酸二钠的主成分色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数均大于3000，拖尾因子良好，在各条件下的测定结果均在均在98.0%～102.0%范围内，说明色谱条件在有微小改变的情况下不影响样品含量测定。

通过上述线性和范围、中间精密度、溶液稳定性、准确度、耐用性等方法验证试验，证明拟定分析方法适用于注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠的依地酸二钠检查，测定结果准确、可靠。

参考文献

[1]王培旭，曲淑君等.186例注射用注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠不良反应报告回顾性分析[J].临床医药实践，2023年11月第32卷第11期：838-840.

[2]雷小平，杨明亮等.注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量分析方法的建立[J].上海医药，2022年第43卷第5期（3月上）：77-80.