眉山市东坡区疾病预防控制中心 检验科 四川眉山 620000
结核实验室痰培养与分子检测是结核病诊断和监测的重要手段。痰培养,也被称为结核病分枝杆菌分离培养检查法,是结核病病原学诊断的“金标准”。该方法主要分为液态培养和固态培养两种,我国推荐使用罗氏培养基简单法进行培养。此外,分子学检查也是结核病诊断的重要方法。目前,结核病细菌学领域以核酸为基础的分子生物学检测技术进展迅速。以下是关于这两种方法的详细描述:
一、结核实验室痰培养
(1)痰培养的原理:分枝杆菌培养是依据分枝杆菌的生长规律,根据营养和代谢需要的条件,人工营造提供出有利于分枝杆菌生长而抑制其他细菌生长的环境,达到分离出分枝杆菌的目的。常用的固体培养有罗氏、改良罗氏培养基、Middlebrook7H10或7H11;常用的液体液体培养以Middlebrook7H9为基础。
(2)痰培养的过程
2.1痰培养前处理
前处理的步骤:①取1-2ml痰标本至前处理管;②视标本性状加入1-2倍体积的4%氢氧化钠;③震荡30s至标本完全液化;④室温静置15分钟(整个处理时间不得超过20分钟)
前处理方法:①简单法-碱处理法:分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点,能耐受碱性消化液的处理,消化液直接接种于酸性培养基上,酸性培养基能中和碱性标本处理液,分枝杆菌能在酸性的培养基上生长。②中和离心法:经含NaOH的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)消化后,磷酸缓冲液(PH6.8)中和后,接种到中心培养基上。
2.2接种
接种的步骤:①准备好两支培养基;②去除培养基中过多的凝固水;③用无菌吸管取前处理后的标本;④接种0.1-0.15 ml(2-3滴)至罗氏培养基斜面;⑤尽量使菌液均匀铺满斜面;⑥每份标本接种2支培养基。
2.3孵育
孵育的步骤:①接种后斜面水平向上,36±1℃孵育24小时;②之后将培养基直立,继续36 ±1 ℃孵育8周(检查瓶盖是否拧紧);③培养箱温度监测。
2.4结果的观察与报告
①接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况(污染、快速生长分枝杆菌);②此后每周观察一次,直至满8周(阴性);③每次观察记录菌落生长及污染情况;④满8周后未见菌落生长,可报告分枝杆菌生长阴性,培养管高压后丢弃;⑤发现显著污染以至无法观察结果,记录“污染”,培养管高压后丢弃;⑥发现疑似分枝杆菌生长,将菌株送上级实验室进行药敏试验
二、分子检测
分子诊断诊断具有检测周期短、检测结果准确可靠的特点。
(1)分子检测的原理:分子检测是通过检测结核分枝杆菌的特异性基因序列来快速、准确地检测结核病的方法。该方法利用了聚合酶链式反应(PCR)技术,将提取的DNA样本进行扩增和检测,以确定是否存在结核分枝杆菌的特异性基因序列。
(2)分子检测的方法:首先需要从样本中提取出DNA,然后利用PCR技术对结核分枝杆菌的特异性基因序列进行扩增。扩增后的DNA片段可以通过荧光或其他方法进行检测,以确定是否存在结核分枝杆菌的特异性基因序列。通过分子检测可以快速、准确地检测出结核分枝杆菌的存在,并且可以判断其耐药性等特征。
(3)分子检测的优缺点:分子检测是一种先进的检测方法,具有快速、敏感、特异性强等优点。它可以对病原体的基因序列进行检测,从而确定病原体种类、耐药性等特征。相比传统的培养法,分子检测可以在数小时内完成检测,大大缩短了检测时间。此外,分子检测可以同时检测多种基因序列,因此可以用于多重病原体的检测,提高了检测效率。但是,分子检测也存在一些挑战和限制。首先,该方法需要专业的设备和技能,只有经过专门培训的专业人员才能操作。其次,分子检测需要严格的实验室质量控制,以确保检测结果的准确性和可靠性。此外,由于PCR技术的灵敏度高,可能会出现假阳性结果,因此需要严格控制实验过程和数据分析。在使用分子检测时,需要结合临床病史和其他检查结果进行综合分析,以避免出现误诊或漏诊的情况。