基于Wnt/β-catenin信号通路探讨绞股蓝皂苷防治脊髓损伤的作用机制

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨绞股蓝皂苷防治脊髓损伤的作用机制

张智，唐龙，叶禾，刘元彬

四川省遂宁市中心医院，四川，629000

【摘要】目的：基于Wnt/β-catenin信号通路探讨绞股蓝皂苷防治脊髓损伤的作用机制。方法：SPF 级雄性SD大鼠50只，随机分为5组，即假手术组，模型组，GPs低剂量（25 mg/kg）组，GPs中剂量（50 mg/kg）组，GPs高剂量（100 mg/kg）组，每组10 只。采用BBB评分评估GPs对大鼠运动能力的影响及GPs的剂量效应；HE染色观察脊髓组织病变；Elisa检测血清中SOD、MDA活性；用Western Blot检测wnt/B-catenin信号通路相关蛋白B-catenin和wnt的表达，结果：GPs低剂量组、GPs中剂量组、GPs高剂量组治疗后大鼠BBB评分均有所提升，GPs高剂量组的评分最高（P<0.05）；GPs高剂量组比各治疗组正常神经细胞数量多，细胞核破裂少，中性粒细胞浸润轻；各治疗组SOD、MDA的表达较模型组均有所降低，其中GPs高剂量组SOD、MDA的表达量减少更明显（P<0.05）；各治疗组β-catenin和Wnt蛋白表达较模型组均有所增加，其中GPs高剂量组增加更明显（P<0.05）。结论：绞股蓝皂苷能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路达到保护脊髓神经元免受氧化应激损伤的作用。

关键词：脊髓损伤；绞股蓝皂苷；氧化应激；细胞凋亡

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是现代社会常见的中枢神经系统损伤，往往导致损伤节段以下严重功能障碍，给家庭、社会带来了沉重负担[1]。近年研究发现，绞股蓝皂苷（GPs）在防治脊髓损伤方面具有一定效用，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，而在绞股蓝皂苷防治脊髓损伤的作用机制中，Wnt/β-catenin信号通路扮演重要角色，一方面，绞股蓝皂苷可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进脊髓损伤后的修复；另一方面，绞股蓝皂苷可能通过抑制炎症反应和氧化应激反应等途径，减轻脊髓损伤后的继发性损伤[2]。基于此，本研究探讨绞股蓝皂苷通过Wnt/β-catenin信号通路防治脊髓损伤的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组

SCI大鼠模型成功建立后，将大鼠随机分为5组，即假手术组，模型组，GPs低剂量（25 mg/kg）组，GPs中剂量（50 mg/kg）组，GPs高剂量（100 mg/kg）组，每组10 只。

1.2方法

1.2.1 行为学检测  采用BBB评分（Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale）评估GPs对大鼠的运动能力的影响以及GPs的剂量效应。

1.2.2 HE染色 建立大鼠SCI模型后48h，各组随机抽取2只大鼠，采用腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥钠处死，心脏灌注后取大鼠脊髓组织，并迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规制备石蜡切片，并行苏木素-伊红染色，脱水封片后于40倍显微镜下观察脊髓组织病变面积。

1.2.3 Elisa法 脊髓组织先按10%比例加入匀浆液，在液氮中反复冻融3次，每次10 min，然后在冰浴中超声3次，每次4 s，4℃下12, 000 rm离心30 min，取上清。检测MDA、SOD含量。

1.2.4 WesternBlot 蛋白裂解液裂解脊髓，经过BCA试剂盒进行蛋白定量，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、脱脂奶粉封闭、用抗β-catenin、Wnt-1蛋白的一抗在4℃条件下孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，用二抗孵育2 h，TBST再洗涤3次，每次10 min，化学显影。

1.3统计学方法

采用SPSS25.0统计学软件进行数据统计分析。正态分布的计量资料以（±s）表示，组间的两两比较均采用LSD检验，P<0.05表示有差异；HE染色的结果图片采用描述性分析。

２ 结果

2.1各组大鼠BBB评分结果

与模型组相比，GPs低剂量组、GPs中剂量组、GPs高剂量组治疗后大鼠BBB评分均有所提升（P<0.05），其中GPs高剂量组的评分最高，与GPs低剂量组、GPs中剂量组相比（P<0.05）。见表1。

表1不同组大鼠BBB评分比较

2.2 HE 染色结果

各治疗组中，大鼠脊髓中炎症细胞浸润较模型组减轻，神经细胞损伤程度减轻；GPs高剂量组比各治疗组正常神经细胞数量多，细胞核破裂少，中性粒细胞浸润轻，见图1。

A组：假手术组；B组：SCI模型组；C组：GPs低剂量组；D组：GPs中剂量组；E组：GPs高剂量组。

2.3各组大鼠血清中SOD和MDA表达结果

各治疗组SOD、MDA的表达较模型组均有所降低（P<0.05），其中GPs高剂量组减少更明显。见表2。

表2 各组大鼠血清中SOD、IL-6含量

2.4大鼠脊髓特异性蛋白β-catenin和Wnt的表达结果

各治疗组β-catenin和Wnt蛋白表达较模型组均有所增加，其中GPs高剂量组增加更明显（P<0.05）。

3讨论

脊髓损伤早期由于存在继发性生理病理改变会在一定程度上造成脊髓微环境改变，促使脊髓神经元细胞凋亡、坏死和自噬不断增强，形成一个恶性循环过程，加速脊髓损伤恶化。有研究[3]表明，新型植物雌激素绞股蓝皂苷能通过减少Muller细胞的凋亡和增强自噬来预防早期糖尿病视网膜病（DR），亦能通过激活自噬从而对阿尔茨海默病的细胞和动物模型进行保护。

本研究使用不同浓度绞股蓝皂苷对脊髓损伤大鼠进行干预，结果表明不同浓度的绞股蓝皂苷有助于改善急性脊髓损伤大鼠运动功能，减少脊髓损伤大鼠脊髓组织的病变面积，降低急性脊髓损伤大鼠神经元细胞的凋亡情况，且中剂量绞股蓝皂苷比低剂量绞股蓝皂苷效果更好，但随着剂量的增加，脊髓组织病变及细胞凋亡较中剂量组并没有获得显著改善，说明绞股蓝皂苷改善急性脊髓损伤有一定的阈值[4]。此外，研究表明，绞股蓝皂苷对脊髓损伤的wnt/B-catenin信号通路特异性蛋白β-catenin和Wnt的表达具有明显调节作用，降低血清中SOD、MDA的表达量。这说明绞股蓝皂苷能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路达到保护脊髓神经元免受氧化应激损伤的作用。

综上所述：绞股蓝皂苷能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路达到保护脊髓神经元免受氧化应激损伤的作用。

参考文献

[1]涂少臣.绞股蓝皂苷ⅩⅦ对急性脊髓损伤大鼠的神经保护及细胞凋亡的影响[J].福建医药杂志,2023,45(4):125-126+179.

[2]孙天宇.探究绞股蓝皂苷ⅩⅦ对大鼠脊髓损伤后的炎症反应及细胞凋亡的影响[D].洛阳,河南科技大学,2022.

[3]王念.绞股蓝皂苷对脊髓源神经干细胞体外培养的影响[D].陕西师范大学,2011.

[4]王惟达,蒋林.miR-495调控MAPK/ERK信号通路对大鼠脊髓损伤后神经元自噬的影响[J].中国免疫学杂志,2023,39(8):1605-1610.

作者简介：张智，男，汉族，1972.10.04，硕士研究生，主任医师，硕士生导师，研究方向：1.脊柱退变性疾病的临床与基础，2.脊髓损伤修复的基础研究。电话：18008258229, 邮箱：zhzi0211@hotmail.com, 地址：四川省遂宁市船山区德胜西路127号遂宁市中心医院脊柱外科。座机号：0825-2292611

通讯作者：刘元彬，男，汉族，1986.01.26，医学硕士，副主任医师，研究方向：脊髓损伤修复的基础研究。电话：13408151356, 邮箱：lybdyxx1986@163.com，地址：四川省遂宁市船山区德胜西路127号遂宁市中心医院脊柱外科。座机号：0825-2292611

基金项目：四川省医学会骨科（尚安通）专项科研课题（2020SAT09）