中和抑制时间分辨荧光免疫法检测乙型肝炎病毒e抗体的性能研究

   中和抑制时间分辨荧光免疫法检测乙型肝炎病毒e抗体的性能研究

谢敬玲

广州市丰华生物股份有限公司  广东广州 510730

摘要：目的对中和抑制时间分辨荧光免疫法（TRFIA）检测乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的性能进行研究。方法应用中和抑制TRFIA检测抗-HBe。评价该方法学的检出限和定量限、准确度、精密度、参考品符合率、线性等分析性能指标。结果检出限和定量限均为0.12IU/mL；国家参考品符合率均能达到检定要求；重复性和实验室内精密度的变异系数（CV）均不高于15.0%；在0.12 IU/mL～3.20 IU/mL内，所有样本的实测浓度与理论浓度值的相对偏差均在±20%范围内，且相关系数均大于0.9800。结论 该方法学精密度好、线性范围宽、准确度高、参考品符合率高，能满足临床检测需要。

关键词：乙型肝炎病毒e抗体；中和抑制时间分辨荧光免疫法；性能评估

乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）是HBV感染的标志，常出现于乙型肝炎病毒表面抗原或乙型肝炎病毒表面抗体阳性的血中。据报道抗-HBe的检出一般见于乙型肝炎的恢复期，较乙型肝炎表面抗体出现略早，可在黄疸出现后4~7周检出，是一个预后良好征象，如患者乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）消失，抗-HBe的出现，表示HBV的复制减弱，传染性减小，病情趋向好转，但近年发现在抗-HBe阳性血中，HBV-DNA也有一定的阳性率，HBV前C区基因突变变异株，可不产生HBeAg，此时仍可有病毒复制。有人认为，持续抗-HBe阳性者，易发生HBV-DNA基因整合现象，易诱导肝癌的发生，如乙型肝炎表面抗原阳性伴抗-HBe阳性同时甲胎蛋白升高者，应密切注意原发性肝癌的可能性。抗-HBe的检出不能做为无传染性的标志，也不是中和抗体[1-3]。

1 材料与方法

1.1  样本  来源于科研合作单位的相关临床样本；乙型肝炎e抗体（HBeAb）血清（液体）标准物质（北京康彻思坦生物技术有限公司）[标物编号：GBW(E)090145和GBW(E)090147]；抗-HBe国际标准品（Paul-Ehrlich-Institut）（代码：129095/12，浓度120 IU/mL）。

1.2  主要试剂  乙型肝炎病毒e抗体测定试剂盒(时间分辨荧光免疫法)[广州市丰华生物股份有限公司]。

1.3  主要仪器   全自动荧光免疫分析仪（AutoTRFIA-4型，广州市丰华生物股份有限公司）。

1.4  方法   检测方法严格按照试剂盒和仪器说明书操作，并按试剂盒说明书对结果进行判读。

1.5  性能评价  根据参考文献[4~10]的方法对乙型肝炎病毒e抗体测定试剂盒的精密度、线性范围、准确度、检出限和定量限、参考品符合率等分析性能指标进行评价。

1.6  统计学分析  根据相关仪器设备测量所得结果，采用EXCEL软件和SPSS Statistics20.0软件进行数据统计分析。

2结果

2.1  检出限和定量限  基于TE值要求建立定量限，依据中国食品药品检定研究院的乙型肝炎病毒e抗体国家标准品的使用方法和要求中的规定，设定本试验抗-HBe的总误差目标值TE为20%，采用6个仪器系统、3个试剂批、3个测试日、5个低浓度水平样本、每个样本进行4次重复测量的实验模型，满足每个试剂批号的低浓度水平样本测试结果数量为60个。使用传统的Westgard model韦斯特加德模型来定义用于该评估的TE值，利用检出限浓度水平样本评价定量限，已知每个用于评价检出限低浓度水平样本的标准值。利用经典方法评价出检出限后，计算每个样本测值与标准值的TE，每个试剂批号对所有样本计算的TE%满足≤20%设定的总误差目标值，因此，检出限=定量限=0.12 IU/mL。

2.2  线性   首先确定该方法学试剂盒预期测定范围，接着对其进行临床可接受的非线性检验，其确定方法主要参考YY/T 1789.4-2022《体外诊断检验系统 性能评价方法 第4部分：线性区间与可报告区间》[9]、《EP6-A 定量测量方法的线性评价：一种统计学方法批准指南》[10]，检测得出其线性区间（测量区间）为0.12 IU /mL~3.20 IU /mL，其r为0.9999。

2.3  准确度  见表1。在试剂盒的线性检测范围0.12 IU/mL～3.20 IU/mL内，所有样本的实测浓度与理论浓度值的相对偏差均在±20%范围内。

表1  所测数据的相对偏差及相关系数

2.4  精密度  见表2。实验采用20×2×2模型，在同一个实验室，由同一（组）操作员在同一台仪器，使用同一批号的试剂盒，在20天（可为非连续天）对临界值样本(0.23 IU/mL，简称:P1)、弱阳性样本（0.80 IU/mL，简称:P2）和中强阳样本（1.60 IU/mL，简称:P3），阴性样本（简称:N1)进行测试。每天上下午各进行一次测试，每个样本重复测试2次。评价结束时，获得40对即80个测量结果。对测量结果进行离群值检验后，再进行数据分析，重复性和实验室内精密度的

CV均不高于15%，符合要求。

表2  TRFIA试剂检测样品精密度的结果

2.5  国家参考品检测  见表3。15份阴性参考品（N1-N15）的符合率为15/15；10份阳性参考品（P1-P10）的符合率为10/10；精密性参考品的CV为1.65%（n=10）；灵敏度参考品稀释成1IU/mL时的检测结果为阳性，均符合国家参考品的要求。

表3  TRFIA试剂检测国家参考品的结果

3讨论目前乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）的检测方法有胶体金法、化学发光法、化学发光免疫分析法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、磁微粒化学发光法和电化学发光法等。本研究的TRFIA试剂精密度不高于15%，准确度相对偏差均在±20%以内，线性r>0.9900准确度，国家参考品符合率100%。时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）相比其他方法学的优势主要有：1.高灵敏度和高特异性：由于时间分辨荧光微球中的稀土元素螯合物在紫外光源的激发下能发射特殊的荧光，具有长荧光寿命，可以有效避免样品中的本底荧光以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。2.宽的线性范围：时间分辨荧光免疫层析技术结合了免疫荧光技术和传统免疫层析技术，具有高特异性、高灵敏度、线性范围宽等多种优势，能满足不同浓度抗原或抗体的检测需求。3.优良的标记载体：作为时间分辨荧光免疫分析技术的基础，优良的标记载体至关重要，微球是免疫层析标记中必不可少的原材料之一。重链生物推出的时间分辨荧光微球具备分散性好，粒径均一，性能稳定等特性，可满足免疫层析产品开发要求。4.分析速度快：时间分辨荧光免疫分析技术可以快速完成样本的检测和分析，提高工作效率。5.无放射性污染：由于该技术不涉及放射性元素的使用，因此不会产生放射性污染，更为安全可靠。总体而言，时间分辨荧光免疫分析法在灵敏度、特异性、线性范围、分析速度和安全性等方面相比其他方法学具有显著优势，能满足临床检测需要。

参考文献

[1]  中华医学会肝病学分会,中华医学会传染病与寄生虫病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[S].2005-12-10.

[2]  毛远丽.HBV血清标志物实验室检测的临床意义[J].中华医学检验杂志,2010,33（4）：382-384.

[3]  李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题[J].中华医学检验杂志,2006,29（5）:385-389.

[4]  徐伟文.体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估[J].分子诊断与治疗杂志，2010,2（2）:140-144.

[5]  罗立梅，张 彬，陈 刚.化学发光微粒子免疫分析法检测性激素6项的性能验证[J].国际检验医学杂志，2017,38（9）:1214-1216,1219.

[6]  YY/T 1789.1-2021 体外诊断检验系统 性能评价方法 第1部分：精密度. 国家药品监督管理局，2021.

[7]  YY/T 1789.2—2021体外诊断检验系统 性能评价方法 第2部分：正确度.国家药品监督管理局，2021.

[8]  YY/T 1789.3-2022 体外诊断检验系统 性能评价方法 第3部分：检出限与定量限.国家药品监督管理局，2022.

[9]  YY/T  1789.4-2022 体外诊断检验系统性能评价方法第4部分：线性区间与可报告区间. 国家药品监督管理局，2022.

[10] NCCLS.EP6-A 定量测量方法的线性评价：一种统计学方法批准指南[S].2010：1-33. NCCLS.EP6-A Evaluation of the Linerarity of Quantitative Measurement Proceduers:A Statistical Approach;Approved Guideline(2010):1-33.

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