Bouin液对含有大量脂肪组织的淋巴结石蜡切片质量的影响

Bouin液对含有大量脂肪组织的淋巴结石蜡切片质量的影响

田昕  王诺  杨晓楠  刘智慧  张冰

齐齐哈尔市中医医院病理科    黑龙江齐齐哈尔  161005

【摘要】目的 对比4%中性甲醛及Bouin液两种固定液对含有大量脂肪组织的淋巴结石蜡病理切片质量的影响，优选适用淋巴结制片的固定液。  方法 选择4%中性甲醛及Bouin液两种固定液，对含有大量脂肪组织的淋巴结进行固定，常规制作石蜡切片、HE染色，对比观察其染色效果。  结果 4%中性甲醛及Bouin液两种固定液对含有大量脂肪组织的淋巴结石蜡病理切片质量存在影响，4%中性甲醛固定的切片偏厚、易碎、不完整、有大空洞，组织结构欠清晰，染色对比不良；Bouin液固定的切片完整易切、平整不脱片、薄厚适中，组织结构较清晰，层次分明。结论 Bouin液固定的有大量脂肪组织的淋巴结切片顺利，着色良好，不引起收缩、空洞及过度硬脆。

【关键词】 Bouin液  4%中性甲醛 固定液 脂肪组织  淋巴结 

淋巴结是免疫系统的一部分，通过过滤淋巴液来清除身体中的废物和病原体。在癌症发展的过程中癌细胞可以进入淋巴液中，并通过淋巴管道扩散到淋巴结，从而形成淋巴结转移癌。淋巴结转移癌是评估癌症严重程度和治疗方案的重要指标之一。在淋巴组织病变的研究中，石蜡切片HE染色仍然是临床病理诊断中最为实用、简便的方法。淋巴结组织由于其细胞成分丰富，间质少，质地较脆，外周有一层较致密的结缔组织被膜，在其被膜外常有厚层的脂肪包绕，结内也经常可见大量的脂肪组织，这种含有脂肪组织的淋巴结中油脂成分较多，使得固定液的渗透力更差，淋巴结固定效果不佳，淋巴结切片过厚、破碎、空洞现象经常发生，结内淋巴细胞及肿瘤细胞结构多数不清楚，细胞核染色质较模糊，较难获得高质量的切片，无法明确是否有淋巴结转移，严重影响诊断的准确性。为此，我们选择4%中性甲醛及Bouin液两种固定液，对比观察两种固定液对含有大量脂肪组织的淋巴结病理切片质量的影响，以期找到合适的固定方法，从而解决淋巴结制片效果不佳的问题。

1材料与方法

1.1材料 

1.1.1组织标本  收集2022年10月-2023年3月本院64例行乳腺癌根治手术切除的腋窝淋巴结标本，每例患者选取2枚淋巴结，淋巴结直径0.5cm - 1.0cm，淋巴结内脂肪组织占比30% - 40%，128枚。

1.1.2试剂

Bouin固定液：将甲醛溶液（37% ～40%）、冰醋酸、苦味酸饱和水溶液分别按照5:1:15的比例配置。

4%中性甲醛固定液：甲醛溶液（37% ～40% ）100毫升、无水磷酸氢二钠6.5克、磷酸二氢钠4.0克、蒸馏水900毫升，按比例配置。

1.2方法  将每例患者选取的2枚淋巴结按照标准取材（大小0.5cm×0.5cm，厚度0.2cm - 0.3cm），淋巴结内脂肪组织占比30% - 40%，分别放入Bouin固定液及4%中性甲醛固定液中固定6h，在全自动脱水机内经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明及浸蜡处理后包埋成蜡块，石蜡切片机连续切片，切片厚4μm，42℃水浴裱片，HE常规染色后封片，光镜下观察比较淋巴结组织结构。

1.3评片标准 切片质量按优、良、差分为三等。评定标准如下：优：组织切面完整，切片厚薄均匀，无皱褶、无裂隙、无刀痕，皮髓质分界清晰，淋巴滤泡清晰，细胞核和细胞质染色对比清晰，核仁分明，细胞无收缩，与生活状态下差别小。良：组织切面稍不完整，切片厚薄不均匀，有细小皱褶、裂隙、刀痕，皮髓质分界欠清晰，淋巴滤泡略模糊，细胞核和细胞质染色对比欠清晰，核仁模糊，细胞有轻度收缩，形态发生一定改变。差：组织切面不完整，切片过厚（细胞重叠），出现大量皱褶、裂隙和刀痕，细胞皱缩，皮髓质分界不清晰，淋巴滤泡模糊，细胞核和细胞质染色对比不清晰，核仁不清，细胞收缩，形态发生改变。【1】

2 结果

4%中性甲醛固定液及Bouin固定液对64例乳腺癌根治手术切除的含有大量脂肪组织的腋窝淋巴结标本固定效果各不相同，所制HE切片镜下细胞形态也有所区别。4%中性甲醛固定的切片偏厚、易碎、不完整、有空洞，组织结构欠清晰，染色对比不良，优质片占71.88%；Bouin液固定的切片完整易切、平整不脱片、薄厚适中，组织结构较清晰，层次分明，优质片占90.63。Bouin液固定效果优于4%中性甲醛固定液（P＜0.05），具有统计学意义。（见表一）

表一  两种固定方法病理切片质量比较

3  讨论

由于淋巴结组织外周有一层致密的结缔组织被膜，结内淋巴细胞丰富，组织结构致密，并且在癌症患者标本中送检的淋巴结表面常有厚层的脂肪组织包绕，淋巴结内也经常见到大量的脂肪组织，脂肪细胞中主要成分是大量的油脂，诸多因素的影响阻碍了固定液、脱水剂、透明剂及蜡液的渗透，组织不易得到充分的固定和脱水，因此淋巴结组织难以制作出优质的石蜡切片，淋巴结内小灶的癌细胞常因制片不佳而增加诊断难度，甚至于漏诊。及时良好的固定是制作优质病理切片的首要步骤，因此想要制作出优良的病理切片，固定液的选择至关重要，适宜的固定液可以迅速渗入组织，使新鲜组织中的蛋白质沉淀，组织内各种成分尽快地被固定在原位置，保持细胞内的成分和状态与生活时相仿，细胞内成分产生不同的折光率，使其结构更加清晰。

固定液的种类繁多，都有各自的优势和缺陷。4%的中性甲醛固定液因配置简单最为常用，但其穿透力较弱，渗透速度较慢，固定时间一般较长8-12h，如果固定不充分，组织结构欠清晰，核仁模糊，细胞收缩。有报道B-5固定液用于淋巴组织的固定，其特点是渗透力强，能迅速渗入组织内部，凝固组织细胞内成分，是组织短时间达到一定的硬度，但要严格控制固定的时间，时间超过4h，染色前需要脱汞处理，否则组织容易破碎，此液由于是用升汞配制，含有重金属离子，对免疫组化效果不好。【2】Bouin固定液由甲醛、冰醋酸以及苦味酸饱和液按5:1:15的比例混合而成。该固定液中的苦味酸可沉淀蛋白质，对胞质固定较好，有软化组织的作用。冰醋酸穿透力强，是良好的核蛋白沉淀剂，能使染色体的保存接近生活状态，并能把未分裂的细胞核染色质沉淀成为可以染色的块状体，细胞核染色显得清楚，核浆颜色对比鲜艳，并且对胶原纤维等组织有轻度膨胀作用，但用量大易使组织发脆。甲醛不能沉淀白蛋白、核蛋白，主要通过蛋白质分子发生交联而产生固定作用，对组织有收缩作用。【3】【4】因为冰醋酸能固定染色质，苦味酸能使组织适当硬化，甲醛可调节前两种试剂对组织的膨胀作用，因此Bouin固定液组织渗透性强且渗透速度快而均匀、组织收缩幅度小，不出现变脆现象，HE染色组织结构清晰完整，对脂肪的固定效果较好，尤其适用于含脂肪组织的淋巴结、乳腺组织和脂肪标本的固定，固定后可直接转入95%乙醇进行脱水。【2】1913年HUNNER首先报告用Bouin液固定睾丸组织，国内1980年陆续有此方面的报道。张会卿等发现，Bouin液固定活检的睾丸组织进行病理诊断，效果明显高于甲醛或95%乙醇。【5】赵玉琼等发现，Bouin液固定的大、小肠道组织的石蜡切片质量优于甲醛固定液。【6】本实验结果表明，经Bouin液固定的淋巴结组织切片完整易切，无空洞，平整不脱片、薄厚适中，淋巴结内组织结构层次分明，癌细胞分布清晰可见。细胞核和细胞质染色对比清晰，核仁分明，细胞无收缩。

综上所述， Bouin液在有大量脂肪组织的淋巴结中固定效果优于其他固定液，切片效果更佳。除了正确地选择固定液外，还要及时充分固定新鲜组织，保证细胞不发生自溶和降解。淋巴结制片是一项细致的技术工作，影响淋巴结制片质量的因素也是多方面的，各个环节都是息息相关的，只有把握住每个环节，才能制作出一张优质的石蜡病理切片。

参考文献

1 中华医学会，临床技术操作规范·病理学分册[M]，北京:人民军医出版社，2004.4：4-7

2 王德田，丁伟，实用现代病理学技术[M]，北京中国协和医科大学出版社，2022.6：12-17

3黄宏森，张超，郭晓珍等.不同固定液及时间对小鼠肝组织结构的影响[J].广州医学院学报，2007,4（35）:65-68

4 孙海梅，尚宏伟，张立新等.不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色标本的影响[J].中国医学装备，2011,8（10）：48-50

5 张会卿，张春婷，睾丸活检BOUIN氏固定液应用观察与研究[J]河南外科学杂志，2001,7（1）:5-6

6赵玉琼，李瑞生等，三种固定液对大、小鼠肠道组织石蜡切片质量的影响，中国比较医学杂志[J]，2014.11(24)：53-56

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