基于微流控技术的血球计数及分析仪器研发与应用

基于微流控技术的血球计数及分析仪器研发与应用

杨海山

身份证号：362102197708144231  广东  深圳  518000

摘要：本文针对基于微流控技术的血球计数及分析仪器展开研究，旨在设计一种通过微流控芯片和库尔特技术实现红细胞、血小板分类计数。首先，概述了微流控技术在血球计数及分析仪器中的应用背景和目的，并介绍了血球计数及分析仪器的发展趋势和主流技术方案。其次，详细阐述了微流控芯片和、电极结构设计，以及红细胞、血小板分类计数和白细胞分类计数的原理与方法。接着，介绍了实验验证和性能测试的内容及方法，并对基于微流控技术的血球计数及分析仪器与主流技术方案进行了对比分析。最后，总结了本文的研究成果，并展望了基于微流控技术的血球计数及分析仪器的未来发展趋势和应用前景。

关键词：微流控技术；血球计数；仪器研发与应用

一、基于微流控技术的血球计数及分析仪器研发与应用

1.1 概述

随着生物医学技术的不断发展，血液分析已成为临床诊断的重要手段之一。血球计数及分析仪器广泛应用于医院、实验室等医疗机构，用于检测血液中红细胞、白细胞和血小板的数量及比例，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。然而，传统的血球计数及分析仪器存在液路设计复杂、维护麻烦和操作复杂等局限性。因此，开发一种新型的血球计数及分析仪器具有重要的现实意义。微流控技术是一种能够在微米级通道中操控微量流体的技术，具有高度集成、成本低、便携等特点，越来越受到研究者的关注。将微流控技术与血球计数及分析仪器相结合，有望实现简化液路系统设计和日常维护、操作简便等优势，可推广应用于基层医疗单位。基于微流控技术的血球计数及分析仪器已成为当前研究热点之一。

1.2 微流控技术简介

微流控技术起源于20世纪80年代，是一种在微米级通道中操控微量流体的技术。微流控芯片是微流控技术的核心部件，通常由顶层和底层组成，其中顶层通常为微通道，底层则为支撑层。微流控芯片的设计和制造涉及微纳米加工、生物化学、流体力学等多个领域。微流控技术具有许多独特的优点，如微量样品消耗、快速反应时间、高通量筛选等。这些优点使得微流控技术在生物医学领域具有广泛的应用前景，如基因测序、蛋白质结晶、细胞培养等。

1.3 血球计数及分析仪器的发展趋势

血球计数及分析仪器的发展经历了多个阶段，从最初的基于光学显微镜的技术，到使用电阻抗、射频、激光散射等技术的现代血球计数仪。随着科学技术的进步，血球计数及分析仪器的性能不断提高，检测精度、速度、自动化程度等方面均有显著提升。然而，传统血球计数及分析仪器仍存在许多局限性，如检测速度慢、精度低、操作复杂等。近年来，随着微流控技术的快速发展，基于微流控技术的血球计数及分析仪器成为研究热点。这类仪器通过将血液样本与微流控芯片结合，利用微通道中的流体力学和生物学特性，实现红细胞、白细胞和血小板的快速、准确计数及分类。与主流技术方案相比，基于微流控技术的血球计数及分析仪器具有更高的检测速度和使用便捷性，展示出广阔的发展前景。

二、血细胞分析仪的主流技术方案

2.1 血细胞分析仪的发展历程

血细胞分析仪的发展历程始于19世纪，随着科学技术的进步，血细胞分析仪的性能不断提高。大致可以分为三个阶段：

（1）初始阶段：在这个阶段，血细胞计数主要依赖于光学显微镜，操作繁琐且精度较低。

（2）半自动阶段：20世纪50年代，电阻抗、射频和激光散射等技术逐渐应用于血细胞分析仪，实现了半自动检测，提高了检测速度。

（3）全自动阶段：20世纪80年代以来，随着计算机技术的普及，全自动血细胞分析仪得到迅速发展。这些仪器可以实现血液样本的自动加载、分析和结果输出，提高了检测效率和精度。

2.2 主流技术方案

血细胞分析仪的主流技术方案包括电阻抗法、射频法、激光散射法和流式细胞术等。电阻抗法通过测量血液样本的电阻抗值实现血细胞计数和分析，具有检测速度快、成本低等优点，但精度相对较低。射频法利用射频信号测量细胞体积，具有较高的检测精度，但仪器成本较高。激光散射法通过检测激光照射在细胞上的散射光强度实现血细胞的计数和分析，具有较高的检测精度和速度，但需要较为复杂的光路系统。流式细胞术利用流式细胞仪对血液样本中的细胞进行高速分析和分选，具有极高的检测精度和灵活性，但仪器成本和操作复杂度较高。

2.3 微流控技术应用优势

微流控技术在血球计数及分析仪器中的应用具有诸多优势。首先，微流控芯片的小型化特点使血球计数及分析仪器更便携，适用于现场检测等多种应用场景。其次，微流控芯片中的微通道加速了流体流动，从而提高了血细胞计数和分析的速度。同时，微流控芯片的制作成本相对较低，有利于降低血球计数及分析仪器的生产成本。基于这些优势，将微流控技术与血细胞分析仪相结合，有望克服传统血球计数及分析仪器的局限性，提高检测效率，降低检测成本，提高检测便捷性，具有广阔的发展前景。

三、基于微流控技术的血球计数及分析仪器的设计与实现

3.1 微流控芯片设计

微流控芯片采用PDMS材料制作,由五层结构组成:底板层、流道层1、电极层、流道层2和顶板层。

1)底板层:厚1mm的玻璃基板,提供芯片的结构支撑。

2)流道层1:厚100um的PDMS层,具有宽100um、深50um的微流道,用于输送样本溶液。流道两端分别连接试剂缓冲室和废液缓冲室。

3)电极层:厚50um的PDMS层,中间开两个直径50um的检测微孔,微孔上下分别布置对称的锥形结构,用于减小流道的截面积,加速流体流动。微孔周围布置上、下环形电极,用于检测细胞 induced current。

4)流道层2:与流道层1相同,但对应检测白细胞的通道。

5)顶板层:厚1mm的PMMA板,开孔连接试剂缓冲室、负压孔等,密封芯片。

微流控芯片的设计和操作需要考虑血液样本在微通道内的流动性，以及如何操控样本的流速，这对于准确的计数和分类非常重要。本设计制作芯片的材料采用高分子聚合物材料聚二甲基硅氧烷（PDMS），PDMS具有价格便宜、方便加工成型的特点。芯片总体结构设计如图1，设计分上下五层。最下面基底层，主要用于就是作为芯片的基板；第二层和第四层是流道层，包含RBC/PLT和WBC两个通道的流道结构；第三层是阻抗检测电极布局层；顶层是样本加液缓冲孔和负压连接孔。在三、四、五层包含两个通道的试剂缓冲室，RBC/PLT通道缓冲室预存储一定量的稀释液，用于二次稀释样本溶液；WBC通道缓冲室预置的是溶血剂稀释液，用于溶解破坏样本溶液中的红细胞和血小板，实现对白细胞的准确计数和分类。在二、三、四、五层包含两个通道的废液缓冲室，缓存经过流道计数产生的废液。

图1 微流控芯片层级结构设计

Fig1. Design of hierarchical structure for microfluidic chips

3.2 电极层结构设计

采用恒流源,供给微安级的恒定电流。当细胞通过检测孔时,会短暂阻塞流道,导致检测孔两端电压产生短暂脉冲信号。信号波形特征与细胞大小、极性相关。电路部分采用差分放大电路,放大检测微孔两端的微小电压变化,然后通过数据采集卡采集放大后的电压脉冲信号。根据统计不同类型细胞诱导的电压信号特征,可以实现对红细胞、血小板和不同类型白细胞的识别和计数。

3.3 红细胞/血小板通道工作原理

1)稀释血液样本至适当浓度,加入适量抗凝剂,防止细胞聚集。

2)加入稀释后的血液样本至流道入口的试剂缓冲室。

3)施加适当的负压,吸引样本经过流道,使单个细胞顺序通过检测孔。

4)细胞通过检测孔时,会诱导微小的电压脉冲信号。

5)根据信号波形特征,识别和计数红细胞和血小板。

6)经过检测的样本最后流入废液缓冲室收集。

四、实验验证与性能测试

为了评估微流控血球计数及分析仪器的临床测试性能，我们采用乳胶微球和临床样本进行了实验验证。

4.1 标准微球测试

实验选用3um、4um、5um和10um的聚苯乙烯微球作为标准粒子模拟验证，3um、4um和5um微球的原始浓度均为1.0X109/L，10um微球的原始浓度为1.0X1010/L。验证使用4um和10um的微球混合溶液模拟RBC和PLT粒子在RBC/PLT通道测试，使用3um、5um和10um微球混合溶液模拟三分群细胞在WBC通道测试。

4.1.1 样品溶液配置

用移液枪吸取4um和10um两种微球原始溶液各100ul，用去离子水混合稀释到500ul，待用作RBC/PLT通道测试溶液。用移液枪吸取3um微球原始溶液120ul，吸取5um和10um微球原始溶液各40ul，用去离子水混合稀释到500ul，待用作WBC通道测试溶液。

检测记录数据经上位机软件分析处理后，得出结果。对于微球验证测试我们只看原始数据里的计数值，RBC计数对应于10um微球的粒子数量，PLT计数对应于4um微球的粒子数量；WBC通道的淋巴系计数对应3um粒子数量，单核系计数对应5um粒子数量，中性粒细胞系计数对应10um粒子数量。

使用10个微流控芯片重复测试10次，统计结果均值如表1所示。从结果数据看，设备对标准微球计数的结果重复性能满足行业标准。

表1 标准微球计数结果

Table1 Count results of standard microsphere

4.2 性能测试

验证仪器的临床性能我们采用高中低值三种质控在仪器上分别测试10次，通过结果与靶值的偏差可以判断仪器准确性和线性，通过结果的变异系数可以判断仪器的重复性能。测试结构整理如表2所示，从表2可以看出仪器主要项目准确性能满足行业要求，线性良好，重复性性能均能满足行业标准要求。

表2 质控血样测试结果

Table2 Test results of quality control blood sample

结束语

综上所述，基于微流控技术的血球计数及分析仪器在血液分析领域具有广阔的应用前景。通过设计微流控芯片和结合库尔特技术实现红细胞、血小板和白细胞的分类计数，可以大大简化仪器的液路系统设计和日常的维护保养，对于样本量少的基层医院使用非常有优势，能提高检测速度、使用的便捷性。与传统的血细胞分析仪器相比，基于微流控技术的仪器具有更小的体积、更快的开机检测速度和更低的成本，适用于急诊和基层医院等应用场景。然而，基于微流控技术的血球计数及分析仪器仍需进一步优化，特别是在流道的流速控制、测试性能和成本方面。随着技术的不断发展，基于微流控技术的五分类血球计数及分析仪器有望进入临床应用，实现更高的性能和更广泛的应用，为临床诊断和治疗提供更准确、快速和便捷的血液分析方法。

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