血液miR-151-3p在脑卒中早期诊断中的作用研究

血液miR-151-3p在脑卒中早期诊断中的作用研究

王晓晓1△，戴宁彬2△，李莉蓉1，郭伟强3*，刘松柏1*

( 苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室，江苏苏州，215009； 苏州市疾病预防控制中心，江苏苏州，215026； 苏州科技大学，江苏苏州，215009)

摘要

目的：探讨血液中miR-151-3p相较于常用的Hcy和CRP等指标在脑卒中患者早期诊断中的作用。方法：选取苏州市疾病预防控制中心2018-2019年间收录的脑卒中患者样本作为实验组，同时选取同一阶段收录的年龄相近正常人群作为对照组，其中实验组55例，对照组45例，观察比较两组患者miR-151-3p、Hcy及CRP表达水平及IL-6、TNF-α等炎症因子表达水平。结果：脑卒中患者血液中miR-151-3p含量远高于正常人群，其含量与IL-6、TNF-α等炎症因子水平呈正相关性。结论：miR-151-3p可以作为较好的脑卒中早期诊断标志物，并且与炎症因子水平呈正相关性，可能通过调控炎症反应促进脑卒中的发生，具有较大的开发和应用价值。

关键词：脑卒中，miR-151-3p，qPCR，标志物，炎症反应

The study of blood miR-151-3p in the early diagnosis of stroke

WANG Xiaoxiao1△, DAI Ningbin2△, LI Lirong1 , GUO Weiqiang3* , LIU Songbai1*

(1 Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology，Suzhou Vocational Health College，Suzhou 215009; 2 Suzhou Center for Disease Control and Prevention, Suzhou, 215026; 3School of Chemistry, Biology and Material Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009.)

Abstract

Objective: To investigate the role of miR-151-3p in the early diagnosis of stroke patients compared with common indexes such as Hcy and CRP. How: Samples of stroke patients collected by Suzhou Center for Disease Control and Prevention from 2018 to 2019 were selected as the experimental group, while normal people of similar age collected at the same stage were selected as the control group, including 55 cases in the experimental group and 45 cases in the control group. The expression levels of miR-151-3p, Hcy, CRP, IL-6, TNF-α and other inflammatory factors were observed and compared between the two groups. Results: The content of miR-151-3p in the blood of stroke patients was much higher than that of normal population, and its content was positively correlated with the levels of IL-6, TNF-α and other inflammatory factors. Conclusion: miR-151-3p can be used as a good marker for the early diagnosis of stroke, and is positively correlated with the level of inflammatory factors, which may promote the occurrence of stroke by regulating inflammatory response, and has great development and application value.

Key words: stroke, miR-151-3p, qPCR, markers, inflammatory response

引言

脑卒中是一类较为常见的心血管疾病，严重威胁人民群众的生活质量和健康[1]。脑卒中具有高发病率、高智残率和预后差等特点，其中约80%的脑卒中为缺血性脑卒中[2]，此外，近年来脑卒中出现低龄化趋势。溶栓治疗是目前最有效的救治方法之一，但有严格的时间要求，一般要求在6小时内进行静脉溶栓。因此，快速、准确的诊断成为脑卒中治疗和早期预防的关键[3, 4]。

目前，伯明翰卒中风险评分（FSP）是已被公认的脑卒中一级预防的有效筛查工具[5, 6]，但仅从年龄、收缩压水平、糖尿病史、吸烟、心血管病病史、心房纤维颤动和心电图诊断的左心室肥厚等因子计算风险评分，评价脑卒中发生会在一定程度上造成脑卒中易患个体的漏诊或误诊[7]。

近年来研究发现，早期血液相关因子水平与脑卒中的发生和预后密切相关[8]，同型半胱氨酸（Hcy）、C反应蛋白（CRP）等已被认为是脑卒中的独立危险因素之一，是脑卒中的重要预测因子，在脑卒中的发生过程中起着重要作用[9, 10]。目前，国内外已逐渐将Hcy、CRP表达水平作为心脑血管疾病的临床常规检测指标，但是，部分感染、慢性疾病等其他因素也可能引起Hcy、CRP水平变化，可能出现假阳性结果，极易导致误诊。因此，找寻更为高效、特异的脑卒中分子标记物成为当务之急[11]。而miRNA分子标记物的找寻和诊断检测已在多种肿瘤的早期诊断中取得突破性进展[12]，在疾病早期诊断中具有及其重要的开发和研究价值，大量研究表明，miRNA在脑卒中发生过程中具有重要调控作用，是潜在的诊断和治疗靶点，并且有数据表明miRNA151-3P与脑卒中的发生密切相关，可能是优质的分子标记物和潜在治疗靶点[13-15]。本文通过对苏州市疾病预防控制中心2018-2019年间收录的脑卒中患者及正常样本进行临床病理参数分类，采用qPCR技术检测血液miR-151-3p含量，使用胶体金法检测Hcy、CRP水平，分析miR-151-3p相较于Hcy、CRP在脑卒中早期诊断中的临床意义和应用价值，为脑卒中的早期预防和治疗提供依据。

1. 材料和方法

1.1 实验材料

实验中所用引物由金斯瑞公司合成；miRNA提取、反转录及qPCR试剂盒购自天根生物科技公司，ELISA试剂盒和胶体金检测试剂购自上海丹施生物。

1.2实验方法

1.2.1 脑卒中临床样本收集及分类：

以苏州市疾病预防控制中心2018-2019年间收录样本为研究对象，对该中心登记建档的脑卒中患者55例，正常人群45例，按照性别、年龄群等进行病理参数分类。

1.2.2 qPCR方法检测血液中miR-151-3p的含量

使用试剂盒提取并分离血液样本中的miRNA，通过加A法将miRNA反转录成cDNA，设计并合成引物（hsa-miR-151a-3p：CUAGACUGAAGCUCCUUG

AGG，U6：CAGCACATATACTAAAATTGGAACG），采用qPCR方法对上述临床病例的血液样本进行检测，测定miR-151-3p含量。

1.2.3 炎症因子IL-6、Hcy、CRP水平检测

采用ELISA法和胶体金法检测不同人群血液样本中IL-6、TNF-α等炎症因子水平，分析其与miR-151-3p的相关性。

1.2.4 统计分析

试验所得所有数据用SPSS 19.0 进行统计学分析，GraphPad Prism作图。基因的相对表达量数值均以平均数±标准误来表示采用ΔΔCt 法计算基因相对表达。

2. 结果

2.1正常人群和脑卒中患者一般资料比较

收集并比较正常人群和脑卒中患者一般资料，其中正常人群45例，脑卒中患者55例，比较其年龄的性别均无统计学差异（P＞0.5），见表一。

表一 两组样本一般资料比较

2.2miR-151-3p可能作为脑卒中潜在标记物

在正常人群、脑卒中患者中采用荧光定量PCR技术检测血液miR-151-3p含量，结果显示（图1A），脑卒中患者血液中miR-151-3p含量远高于正常人群。同时通过胶体金法检测相应样本CRP和Hcy浓度（图1B-1C），结果并无明显差异，该结果提示miR-151-3p是较好的脑卒中诊断标记物，具有巨大开发和应用价值。

图1 miR-151-3p、CRP和Hcy含量检测

2.3血液miR-151-3p含量与相关炎症因子水平呈正相关

采用ELISA法检测不同人群血液样本中IL-6、TNF-α等炎症因子水平，分析其与miR-151-3p的相关性。结果显示（图2）：血液miR-151-3p含量与IL-6、TNF-α等炎症因子水平呈正相关性。该结果提示miR-151-3p与炎症发生密切相关，并且可能通过调控炎症反应促进脑卒中的发生。

图2 IL-6、TNF-α炎症因子水平检测

3.

结论

随着分子生物学、生物化学等多学科的进步和发展，分子诊断已成为多种疾病、病毒等早期诊断的核心手段，荧光定量PCR（qPCR）技术因具有高效、特异、快速、准确等特点，使其成为临床分子诊断的金标准，在外源病毒检测、肿瘤个性化诊疗等方面发挥着重要的作用。miRNA 是真核生物中广泛存在的内源性的非编码单链小分子RNA，在多种疾病的发生、发展等过程中起着重要的调控作用，被认为是极具潜力的疾病诊断分子标记物和治疗的新靶点。

脑卒中作为常见的心血管疾病，严重威胁人民群众的生活质量和健康，现行诊断方法和指标难以满足临床需求。本文通过对脑卒中患者、和正常人群进行临床病理参数分类，采用qPCR技术检测血液miR-151-3p含量，使用胶体金法检测Hcy、CRP水平，分析miR-151-3p相较于Hcy、CRP在脑卒中早期诊断中的临床意义和应用价值。在此次研究中，我们发现脑卒中患者中miR-151-3p表达量明显高于正常人群，而Hcy、CRP表达差异不明显，可能与本次研究选取的样本范围相关，但通过此次研究我们证实了miR-151-3p是更适合的脑卒中早期诊断分子标记物，并且可能与炎症反应密切相关，为脑卒中相关miRNAs分子标记物找寻和临床应用提供依据，也为脑卒中的预防和分子治疗提供依据，为患者争取更多时间和生存希望。

参考文献

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作者简介：王晓晓（WangXiaoxiao，1990-），女，硕士研究生，苏州卫生职业技术学院，助理实验师；△同为第一作者

* 通讯作者，刘松柏郭伟强（Guo Weiqiang）

基金项目：苏州科技局民生科技医疗卫生应用基础研究项目，SYSD2017061；江苏高校“青蓝工程”中青年学术带头人

江苏省“六大人才高峰”高层次人才选拔培养项目（YY-170）；江苏省第五期“333工程”科研项目(BRA2019329);江苏省卫生健康委科研项目（M2022109）