高通量测序技术在临床医学中的应用

高通量测序技术在临床医学中的应用

张路强

杭州度安医学检验实验室有限公司  浙江省杭州市  311100

摘要：现行的高通量测序技术是第二代测序技术，与第一代技术相比在速度、精准度和成本方面有明显优势。如今，高通量测序技术在医学领域的应用越来越广泛，对我国医学领域的发展也能起到促进作用。基于此，本文重点对高通量测序技术进行阐述，结合高通量测序技术的原理分析了该技术在临床医学的应用路径，以期为相关领域提供更多的理论参考依据。

关键词：高通量测序技术；测序技术；临床医学

引言

新一代的测序技术实际上就是我们所说的高通量测序技术，在传统测序技术基础之上有明显提升，高通量测序技术能够实现同时测序上千万条DNA序列，从而实现对某个物种整体转录组和基因组的深入分析。随着高通量测序技术的发展，该技术已经在医学领域得到广泛应用，尤其是在肿瘤、寄生虫病、遗传病等体现出了特有的效果。所以，高通量测序技术也成为我国医学领域的重要技术。

一、高通量测序技术的概述

（一）高通量测序技术介绍

高通量测序技术，也称为“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology）或大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS），是一种能够一次并行对大量核酸分子进行序列测定的技术。该技术运用了生物信息学、纳米孔测序和并行测序等多种技术，能够高效、快速、准确地测定大量核酸分子的序列。与传统的Sanger双脱氧法测序相比，高通量测序技术具有更高的测序速度和更高的通量，一次测序反应就能产出不低于100Mb的测序数据。高通量测序技术的应用范围非常广泛，包括基因组学、遗传学、分子生物学、临床医学和癌症研究等领域。通过该技术，我们可以对特定基因组或全基因组进行深入研究，发现新的基因及其变异体，了解基因的表达调控机制，为疾病的治疗和预防提供依据。虽然高通量测序技术已经取得了许多重要的成果和突破，但仍然存在一些挑战和限制，如数据分析和解读的难度、对实验条件和操作技能的要求、伦理和隐私问题等。未来的研究将继续改进和完善该技术，提高其测序的深度、广度和精度，以更好地满足科研和临床的需求[1]。

（二）高通量测序技术的原理

高通量测序技术采用了大规模平行测序技术，可以同时对多个DNA片段进行测序。每个DNA片段都被打断成一系列长度在200-500bp之间的片段，并且在其两端添加了特定的序列标签。这些标签使得这些片段可以在后续的测序反应中被准确地识别和区分[2]。

在测序过程中每个DNA片段都被克隆到一个质粒载体上，然后将这些质粒转化到大肠杆菌中。对于每个测序反应，科学家们从转化后的菌落中挑出一个单菌落，并对其中的质粒进行纯化。纯化后的质粒被用作模板，用于合成测序反应所需要的寡聚核苷酸。在进行测序反应时，每个循环都包含四个不同的DNA合成反应，每个反应中都会加入一种不同的脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP的2'和3'位置上都不含羟基，因此在DNA的合成过程中无法形成磷酸二酯键，也就是说，ddNTP无法正常参与到DNA链的延伸过程中。经过测序反应后最终得到一组长几百至几千碱基的链终止产物，它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上。通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于每个循环都会产生大量的数据，因此需要使用计算机进行数据处理和分析，以解析出每个DNA分子的序列[3]。

总的来说，高通量测序技术的原理是基于对DNA分子的合成反应进行检测和解析，从而确定每个分子的序列。这种技术采用了大规模平行测序技术，使得科学家们可以同时对多个DNA片段进行测序，大大提高了测序的效率。

二、高通量测序技术在临床医学中的应用路径

高通量测序技术与传统的测序技术相比，在精确度、灵敏度、成本低方面有很多优势，所以该技术在医学领域的应用较为广泛，且该技术具备较为可观的发展前景。

（一）高通量测序技术在肿瘤学方面的应用

高通量测序技术在肿瘤学方面的应用主要体现在对肿瘤基因组的测序和分析上。通过基因组重测序，可以发现肿瘤细胞中存在的基因变异、染色体拷贝数变化、基因表达异常等现象，从而帮助医生对肿瘤进行精确诊断、预后评估和药物选择。首先，高通量测序技术能够对肿瘤组织的基因组进行测序，可以发现肿瘤细胞中存在的基因变异、染色体拷贝数变化等现象，为肿瘤的诊断和分类提供依据。同时，通过对正常组织的基因组进行测序，可以排除遗传因素对肿瘤的影响，帮助医生更好地判断肿瘤的发病原因。其次，寻找肿瘤敏感基因。一些肿瘤具有遗传倾向性，例如：BRCA1和BRCA2基因的突变与乳腺癌和卵巢癌的发病密切相关。高通量测序技术可以检测这些敏感基因是否存在变异，从而帮助医生预测肿瘤的发生风险和制定个性化的预防措施。再次，通过对肿瘤组织的基因组进行分析，可以发现一些与肿瘤细胞增殖、转移和耐药性相关的基因变异，从而为医生提供个性化的治疗策略。例如，针对EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者，可以选择吉非替尼等靶向治疗药物。最后，通过对肿瘤组织的基因组进行分析，可以评估肿瘤的预后情况，预测患者的生存时间和复发风险。例如，通过对乳腺癌患者的基因组进行测序，可以判断其是否属于高风险人群，从而制定更加精确的预后治疗方案。

（二）高通量测序技术在临床遗传疾病无创筛查中的应用

将该技术应用在临床遗传疾病无创筛查主要体现在以下两个方面：一方面是无创产前筛查。无创产前筛查是一种通过抽取孕妇外周血，利用高通量测序技术对胎儿的染色体非整倍体异常进行检测的方法，具有无创伤性、高检出率和高通量等特点。无创产前筛查可以检测出21-三体综合征、18-三体综合征、16-三体综合征等常见染色体均为非整倍体异常形式，总体检出率高达99%，假阳性率不超过0.1%，准确性较高。该技术在孕周范围较大，适用于中高风险孕妇的筛查，能够有效减少介入性产前诊断的数量，缓解产前诊断在技术和人员方面的不足。另一方面则是胚胎植入前遗传学检测。胚胎植入前遗传学检测是一种在体外受精胚胎移植前，利用高通量测序技术对胚胎进行染色体异常检测的方法。该技术适用于年龄较大、既往生育过异常胎儿、家族中有遗传疾病史等高风险人群。通过检测胚胎的染色体是否存在异常，可以帮助选择健康的胚胎进行移植，从而提高妊娠成功率和生育健康孩子的几率。

（三）高通量测序技术在临床病原微生物鉴定方面的应用

将高通量测序技术应用在临床病原微生物鉴定方面，主要是将其应用在感染性疾病病原体鉴定和病原体分型及流行溯源中。传统的病原微生物鉴定主要是采用生态学、生化反应等方法，这种方法花费时间较长且整个鉴定过程较为繁琐。虽然PCR分子诊断技术能够有效解决传统鉴定方法中的部分问题，但是对于微生物领域仍然还需面对很多难题。而采用NGS检测时并不需要专门对病原体实施分离培养，对已知核酸序列也不会产生依赖性，能够实现直接测序鉴别标本，能够有效缩短检测时间。在病原体鉴定方面，NGS主要应用于细菌、真菌和病毒等感染性疾病的检测，具有无可比拟的优势。病原体的分型方法包含多种，如：基因重组序列扩增、脉冲场凝胶电泳等，但是这些技术的分辨率无法得到保障，如果被检测的病原体相似度或者变异度较高，检测结果很难得到保证。应用NGS技术刚好能够完善传统分型方法的不足，通过该技术检测能够全面掌握病原体的全基因组序列，也能掌握病原体的全部遗传信息，所以该方法在医学领域得到了高度认可。通过病原体全基因组测序，可以追踪病原体的流行趋势和传播路径，为预防和治疗感染性疾病提供重要依据。

结语

总而言之，高通量测序技术在临床医学中的应用不断深化，并取得了一定的成果。然而该技术在应用过程中同样面临一定的挑战，如：结果分析解读的难度较大、临床应用中涉及到伦理和隐私问题等，就需要不断完善实验室的质量管理和标准化操作流程，提高临床医生的认知和能力水平，才能实现精准医学的目标。

参考文献

[1]沈寅琛,蒙燕,曾革等.新一代高通量测序技术在产前胎儿CNVs检测中的应用效果[J].中国计划生育学杂志,2023,31(08):1987-1990.

[2]何建萍,吕梦欣,秦茂华等.应用高通量测序技术对昆明地区人群珠蛋白生成障碍性贫血基因的筛查研究[J].现代检验医学杂志,2022,37(05):6-8+49.

[3]陈红梅,张建欣,赵英仁.宏基因组高通量测序技术在感染性疾病病原诊断中的临床应用[J].临床内科杂志,2022,39(09):622-625.