脱细胞羊膜临床应用的研究进展

脱细胞羊膜临床应用的研究进展

杨楠  宋艳 李小文  陈涛蓉 刘谦 颜静 通讯作者  古永洁

四川大学华西第二医院   610066 

摘要  随着组织工程的发展，脱细胞羊膜因其独特的生物学特征与物理学特性脱颖而出，俨然成了最近研究的热点。目前脱细胞羊膜在动物试验中已广泛应用于皮肤、角膜、黏膜、软骨、骨、神经等组织损伤的修复和再生，但在临床应用范围不广。本文从脱细胞羊膜的制备、生物学特性、动物实验研究、临床应用做一综述，为脱细胞羊膜应用于患者各类组织或器官上的修复和再生提供参考价值。

关键词 羊膜；脱细胞羊膜；生物材料；组织修复；再生；临床应用

Progress in clinical application of acellular amniotic membrane

Abstract  With the development of tissue engineering, acellular amniotic membrane has become a hot topic recently because of its unique biological and physical characteristics. At present, acellular amniotic membrane has been widely used in animal experiments in the repair and regeneration of skin, cornea, mucosa, cartilage, bone, nerve and other tissue injuries, but it is not widely used in clinical application. In this paper, the preparation, biological characteristics, animal experimental studies and clinical applications of acellular amniotic membrane are reviewed, providing reference value for the application of acellular amniotic membrane in the repair and regeneration of various tissues or organs of patients.

Key words amniotic membrane; Acellular amniotic membrane; Biological materials; Tissue repair; Regeneration; Clinical application

引言

人脱细胞羊膜（HAM）是胎儿胎盘的最内层与羊水接触，厚度为20-500um[1]，表面积1500cm2[2],无神经、血管、淋巴，有弹性、韧性的一种半透明生物膜，由基底膜层和致密层组成。基底膜层使得羊膜具有三维立体弹性网状结构的物理学特征，使其可抵抗一定张力[3, 4]，并对各种细胞的粘附和增生起到锚定作用。人羊膜含有各种生长因子，具有抑制新生血管形成、抗菌、抗纤维化、免疫调节、良好的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等生物特性[5, 6]。且易于保存、运输，成本低，使用方便等特点[7]。目前多个医学领域学科已经发现HAM的临床价值，且广泛应用于皮肤、角膜等组织的修复和再生[1, 8]。

1 HAM的制备

新鲜人羊膜具有5层结构，分别为单层上皮细胞层、无细胞的基底膜层、致密层、纤维母细胞层和海绵层[9]。经脱细胞去除上皮细胞层、成纤维细胞和海绵层，仅保留基底层和致密层纤维网状结构[10]。HAM的制备包括物理、化学和酶消化法，物理常使用搅拌、超声处理、调节压力、机械按摩及反复冻融去破坏细胞膜释放细胞内容物；化学法主要通过使用酸、碱、有机溶剂、螯合剂、洗涤剂、低渗或高渗透溶液去破坏细胞膜和细胞间与细胞外连接的化学键。酶消化法是用蛋白酶或核酸酶等切割核苷酸健或肽键[11]。HAM常采用机械法或化学法制备，但有细胞残留。采用酶消化法和化学去垢剂能有效的去除羊膜中的细胞成分，仅保留羊膜的纤维网状结构[1]。雷宁静等[12]实验表明TritonX-100法和胰蛋白酶、EDTA酶消化法处理新鲜羊膜优于甘油浸泡和胰蛋白酶、EDTA酶消化法，虽然两种方式均能有效去除细胞，但TritonX-100处理的羊膜可见纵横交错的三维立体纤维空间结构，不含坏死组织且基底成分完整。Milan等[13]比较不同脱细胞方案，试验显示均能有效去除细胞，但用2M过氧乙酸脱细胞效果优于5%氯化铵、0.5M NaOH、0.02%EDTA

、1%TritonX-100、2%十二烷基硫酸钠（SDS）等方法。

2 HAM的生物特性

HAM的基底膜上有I、III、IV、V、VII型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、板层体、整合素、丰富的纤维。经脱细胞处理后，保持基底膜特性，为细胞生长提供三维立体生物空间结构，有利于与羊膜共培养的细胞粘附和生长。人羊膜中还含有多种生长因子，如转化生长因子（TGF-β）、表皮生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、金属蛋白酶组织抑制因子等，这些细胞因子可促进多种细胞与羊膜的粘附、迁移、增殖、分化，使其具有抑制新生血管形成、抗纤维化、抗炎、抗粘连、低免疫原性、细胞共培养载体等特点。

3 HAM的动物实验研究

随着生物工程技术的发展，HAM已经成为组织工程的研究热点，国内外许多学者在动物研究上进行了大量实验，广泛应用于皮肤、黏膜、软骨、神经、骨组织等的修复和再生。Sang等[10] 鸡模型动物实验发现HAM应用于肌健损伤，肌健伤口愈合好且无粘连、拉伸强度高，表明羊膜能促进内源性愈合和屏障外源性愈合。Simeoni等[14]在兔子模型实验表明HAM可用于气道成形和重建，与人脐带间充质干细胞（hucMSCs）相结合可改善气道重建后的纤维化。Wang等[15]在大鼠模型实验显示脐带间充质干细胞（UCMSCs）与脱细胞羊膜基质移植到损伤的子宫内膜,可增厚子宫内膜、促进血管形成、改善子宫内膜柔韧性。Zhang等[16]兔模型实验表明兔冷冻保存的自体皮肤上皮细胞（SEC）与脱细胞羊膜可促进尿道修复。Tang等[17]兔模型实验表明把HAM与骨髓间充质干细胞植入缺损骨组织，有利于缺损骨组织重建。在动物模型实验中HAM已成为了组织修复和重建的最具潜力的生物材料，大量的动物模型实验也为临床研究奠定了基础。

4 HAM的临床应用

4.1皮肤组织损伤修复

HAM在皮肤组织的应用主要包括体外构建活性复合皮肤、皮肤种子细胞的培养、皮肤支架材料。可用于急性皮肤损伤、慢性伤口、迁延性伤口、炎性伤口的处理。Milan等[13]对12例全身表面积平均烧伤在20%～40%之间的II°烧伤患者进行临床试验研究，HAM治疗组平均愈合时间为13.16±5.12天，对照组伤口平均愈合时间为23.33±7.43天，差异有统计学意义（P<0.001），提示HAM促进急性损伤伤口愈合。美国一项多中心前瞻性随机对照临床试验，对110例糖尿病慢性下肢溃疡患者进行为期12周的研究，意向性分析（ITT）提示实验组愈合率为70%（38/54），对照组为50%（28/56）。差异有统计学意义（P=0.0338），证实脱细胞羊膜治疗糖尿病足创面愈合率较高[18]。Su等[19]的系统评价和荟萃分析，共纳入7篇随机对照试验，涉及465名慢性糖尿病足患者，脱细胞羊膜治疗组在第6周时的愈合率是对照组的3.88倍（RR:3.88[95%CI:2.34,6.44]）,第12周的愈合率是对照组的2.01倍（RR:2.01[95%CI:1.45,2.77]），羊膜组完全愈合时间明显更短（MD:-30.33天，[95%CI:-37.95,-22.72]）。Hashemi等[20]对5名30～60岁慢性糖尿病足患者，进行为期9天Wharton胶源间充质干细胞（WJ-MSC）、真皮成纤维细胞（DFs）与脱细胞羊膜共培养的移植治疗，治疗前伤口平均表面积为70.69mm2,分别在治疗第3、6、9天下降到35.25、15.11、4.15 mm2。在治疗的第6、9天伤口的大小和愈合时间显著减少（p<0.002）,第9天实现完全的皮肤再生和再上皮化。Wu等[21]对4名下肢静脉溃疡患者行HAM移植术，2例完全上皮化，第1例在第三周完全上皮化，第2例在第2个月。总体而言，4例溃疡创面修复平均大小为>50%。溃疡深度均明显减少、疼痛缓解、脓液和分泌液完全消失，缩短治疗时间，减轻患者经济压力。众多学者的研究显示HAM对临床上的急性皮肤损伤、慢性伤口、迁延不愈伤口、炎性伤口的愈合效果显著，降低感染风险、减轻患者的疼痛及经济负担。

4.2角膜损伤修复

在眼科领域，根据手术的目的和适应症，羊膜手术可分为羊膜覆盖、羊膜移植、羊膜填充。羊膜覆盖术主要把羊膜作为生物覆植物促进自身角膜上皮的修复，主要治疗眼球粘连等眼表疾病，重建正常眼组织；羊膜移植术羊膜主要提供基底膜供上皮生长，用于治疗角膜或结膜的急性损伤；羊膜填充术主要在于修复眼肌损伤、非感染性角膜或巩膜溃疡或穿孔[5]。目前羊膜覆盖术、羊膜移植术、羊膜填充术已在临床开展并取得了初步成效。Jung等[22]在3例感染性或非感染性巩膜缺损的回顾性报道中，使用脱细胞羊膜覆盖术，2名术后7天实现上皮完全再生，其余1名术后2

5天实现完全上皮再形成，术后随访移植物表面稳定。Lee等[23]报道1例Stevens-Johnson综合征，使用脱细胞羊膜移植术后，术后8个月移植创面稳定，未出现肉芽肿、细菌感染等并发症。Oh等[24]报道一例获得性前巩膜葡萄肿伴穿孔，把脱细胞羊膜填充到穿孔区域，术后4个月，创面稳定，前巩膜葡萄肿好转。由此可见，在眼科领域，HAM的应用可有效减轻炎症、减轻瘢痕形成、减少粘连发生、促进伤口愈合、降低眼球摘除的风险，是眼部组织重建手术的理想生物材料。

4.3术后皮肤组织的重建

HAM因其独特的生物学特征和物理特性作用，在急性皮肤损伤、慢性伤口、迁延不愈伤口、炎性伤口的愈合上取得显著效果，在角膜的修复上也取得初步成效。在其他临床外科修复手术中同样也起到不可替代的作用。Xue等[25]报道180例鼻病灶切除术后患者，92例患者接受HAM治疗，研究表明HAM组止血时间显著缩小（P<0.001），术后疼痛消失快，平均时间为6.36小时（P<0.001），术后结痂的形成（4.75天）和脱痂（6.7天）（P<0.001）时间早。同时也降低了术后出血、伤口感染及疤痕形成。当鼻部病灶直径超过5mm时，HAM组伤口愈合时间显著缩短。Chen等[26]研究表明HAM用于耳廓皮肤病变切除术后皮肤缺损替代品，可缩短疼痛时间、止血效果佳。对于皮肤缺损直径≥5mm时，可明显加速伤口愈合，促进痂壳早期脱离且未出现感染及疤痕等并发症。薛斯亮等[27]对38例甲床手术患者进行随机单盲前瞻性研究，HAM组术后创面愈合时间为12.37±2.48天，对照组需要17.68±2.86天，差异有统计学意义（P<0.05）。该研究还显示HAM可以促进甲床手术后创面愈合，减轻疼痛，缩短疼痛时间，促进甲生长且不影响甲板最后形态。总而言之，在临床外科领域，HAM已应用于鼻、耳廓、甲床的修复和再生，不仅可促进创面愈合、减轻疼痛，且能降低伤口感染、减少瘢痕形成，亦是外科术后组织修复不可替代的生物材料。

5 结语

HAM是一种无血管神经及淋巴、生物组织相容性好、无细胞毒性，含有促进细胞黏附、生长、增殖、分化、迁移的细胞因子，三维立体生物空间结构有利于细胞粘附和生长，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且降解产物为氨基酸，无毒副作用。HAM不含HLA-II类抗原，具有低抗原性，且脱细胞羊膜来自于废弃的胎盘组织，无医学伦理争议，价格低廉，易制备，可室温储藏，是一种理想的天然生物活性膜材料[9, 7]。在动物实验模型中，已用于皮肤、肌健、气管、胃肠道、子宫内膜、尿道、膀胱、骨等修复和再生。在临床上，HAM目前已应用到皮肤、黏膜、甲床、角膜、鼻、耳廓的修复。随着组织工程的发展，HAM将来亦可用于临床患者的气道、食道、胃肠道、子宫内膜、尿道、膀胱、肌腱、骨损伤修复和再生。总之，HAM的出现为患者的组织移植修复和再生开辟一种新的生物治疗方法，具有广阔的应用价值和推广前景。

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