miR-140在人胃癌和正常胃组织中的表达水平及对SGC-7901胃癌细胞功能的影响

miR-140在人胃癌和正常胃组织中的表达水平及对SGC-7901胃癌细胞功能的影响

王显艳1*  ,孙玉荣1 ,高峰2  ,王绍清1 ,王晓英1  ,张懿薇1

1. 齐齐哈尔医学院病理学院  2. 齐齐哈尔医学院附属第三医院麻醉科，黑龙江 齐齐哈尔 161006

【摘要】目的 研究微小（micro）RNA（miR）-140在人胃癌和正常胃组织中的表达水平及对SGC-7901胃癌细胞功能的影响。方法 采用实时荧光定量PCR检测人体正常胃组织与胃癌组织的miR-140表达水平。分别将miR-140的上调表达与下调表达转染至人SGC-7901胃癌细胞中，并设置未转染组作为空白对照组（C组），设置miRNA无义序列转染作为阴性对照组（NC组），对比各组细胞活力、生长抑制率、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭的情况。并检测各组细胞中组蛋白脱乙酰酶4（HDAC4）蛋白表达水平。结果 胃癌组织的miR-140表达量为低于胃部正常组织；与C组、NC组相比，miR-140上调转染组在转染后24~72h时间段内的细胞生长活力下降，细胞生长抑制率升高，G0/G1期比率升高，S期、G2/M期比率下降，细胞凋亡率升高，细胞迁移率、细胞侵袭率下降，HDAC4蛋白表达量下降；miR-140下调转染组在转染后36~72h时间段内的细胞生长活力上升，细胞生长抑制率下降，G0/G1期比率下降，S期、G2/M期比率升高，细胞凋亡率下降，细胞迁移率、细胞侵袭率升高，HDAC4蛋白表达量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 人体胃癌组织相比正常胃部组织的miR-140表达水平降低，对胃癌细胞的活力、周期、凋亡、迁移、侵袭以及HDAC4表达产生调控作用，有望成为胃癌诊治中的一个有价值的靶点。

【关键词】 胃癌；miR-140；SGC-7901胃癌细胞；增殖；凋亡；侵袭

基金资助：齐齐哈尔市科技计划联合引导项目(LHYD-202026)

* 通讯作者：E-mail: 110686462@ qq.com

胃癌是临床上较为常见的一类消化系统恶性肿瘤，胃癌细胞所产生的增殖、转移、侵袭等细胞活动是导致患者病情加重、死亡风险增加的重要原因[1]。细胞活动是一个复杂的过程，在如今的相关研究不断深入中，发现了微小（micro）RNA（miR）参与肿瘤的发生、发展。miR在关于肿瘤病理机制的研究中被逐渐重视[2]。miR-140在个别研究中被发现与恶性肿瘤的发生及进展有关[3]。但需要更多的实验研究数据支撑该观点。本文将分析miR-140在人胃癌和正常胃组织中的表达水平及对SGC-7901胃癌细胞功能的影响，旨在探究miR-140作为胃癌临床诊治靶点的价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2021年6月至2023年2月肿瘤外科收治的经病理检查证实为胃癌的40例患者，将其病理检查时手术切除的胃癌组织作为胃癌组织标本，并以距离胃癌肿瘤10cm以外的正常胃组织作为正常胃癌组织标本。

1.2 检测标本中的miR-140表法水平

采用TRIzol 提取试剂盒提取胃癌和正常胃组织样品中总RNA，运用miR-140特异性逆转录引物与miR cDNA第一链合成试剂盒转录合成 cDNA。由Invitrogen 设计合成 miR-140 和内参照 U6 实时PCR引物。实时荧光定量 PCR预混液分别加入 miR-140 或 U6 引物、cDNA 模板置于ABI7300 实时荧光定量 PCR仪上进行扩增检测。miR-140和内参照U6均设置3个复孔，每个样品经3次重复检测，采用 2－ ΔΔCt 方法对胃癌组织标本和正常胃癌组织标本中 miR-140 相对表达量进行比较。

1.3 SGC-7901胃癌细胞转染

人胃癌细胞株 SGC-7901 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，将其复苏后，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中进行细胞的培养，培养温度为37℃，培养环境为5%的二氧化碳细胞培养箱。运用脂质体进行转染，分别将miR-140的上调表达与下调表达转染至人SGC-7901胃癌细胞中。并设置未转染组作为空白对照组（C组，仅仅加入脂质体），设置miRNA无义序列转染作为阴性对照组（NC组，加入脂质体与miRNA无义序列）。

1.4 观察指标

（1）观察各组细胞活力的变化以及生长抑制率。通过MTT检测获得，以吸光度A值来反映细胞活力。并分别在更换不同浓度顺铂（0、5、10、15、20μmol/L）的培养基中，分别运用MTT检测A值。生长抑制率=（1-加药后A值）/未加药对照A值×100%。

（2）观察各组细胞周期与细胞凋亡率情况。通过流式细胞术检测各组细胞周期变化。使用浓度为10μmol/L的顺铂作用于各组细胞来检测细胞的凋亡情况。

（3）观察各组细胞迁移与细胞侵袭的情况。通过Transwell 小室检测法获得，阳性细胞则呈现为紫色。

（4）检测各组细胞中组蛋白脱乙酰酶 4（HDAC4）蛋白表达水平。通过Western blot 检测法获得，用 Quantity One 软件分析各组转染后细胞中HDAC4蛋白相对表达量。

1.5统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，所有数据进行正态性检验，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料用[n(%)]表示，采用x2检验。当P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与胃正常组织的miR-140表达情况

胃癌组织标本的miR-140表达量为（0.96±0.29），低于胃部正常组织标本的miR-140表达量（3.37±0.38），其差异具有统计学意义（t=31.886，P＜0.001）。

2.2 各组细胞的miR-140表达情况

相比于C组、NC组，miR-140上调转染组的miR-140表达量明显上升，其差异具有统计学意义（t=24.837、23.915，P＜0.001）；相比于C组与NC组，miR-140下调转染组的miR-140表达量明显下降，其差异具有统计学意义（t=13.258、10.276，P＜0.001），见图1。说明miR-140上调转染与miR-140下调转染SGC-7901胃癌细胞成功。

图1  各组细胞的miR-140表达情况

2.3 各组细胞的活力及生长抑制率对比

与C组、NC组相比，miR-140上调转染组在转染后24~72h时间段内的细胞生长活力明显下降（与C组对比：t=4.243、6.957、9.648、13.156、14.546，均P＜0.001；与NC组对比：t=4.427、8.854、10.525、10.752、15.811，均P＜0.001）；miR-140下调转染组在转染后36~72h时间段内的细胞生长活力明显上升（与C组对比：t=6.325、6.325、7.894、11.926，均P＜0.001；与NC组对比：t=4.427、5.692、4.427、10.435，均P＜0.001），见图2。

与C组、NC组相比，在不同浓度顺铂的作用下miR-140上调转染组细胞生长抑制率明显升高（与C组对比：t=4.418、9.844、12.042、14.496，均P＜0.001；与NC组对比：t=3.766、9.844、12.042、14.496，均P＜0.001）；miR-140下调转染组的细胞生长抑制率明显降低（与C组对比：t=2.674、2.994、4.652、2.574，均P＜0.001；与NC组对比：t=2.213、3.253、4.864、2.450，P=0.040、0.004、0.001、0.025），见图3。

图2  各组细胞的细胞活力

图3  转各组细胞的细胞生长抑制率

2.4 各组细胞周期及凋亡率情况对比

与C组、NC组相比，miR-140上调转染组的G0/G1期比率升高（t=17.380、15.710，均P＜0.001），S期比率下降（t=7.378、8.903，均P＜0.001），G2/M期比率下降（t=26.400、10.386，均P＜0.001）；miR-140下调转染组G0/G1期比率降低（t=11.468、9.445，均P＜0.001），S期比率升高（t=4.388、3.082，P=0.001、0.006），G2/M期比率升高（t=8.187、4.403，均P＜0.001），见图4。与C组、NC组相比，miR-140上调转染组的细胞凋亡率升高（t=21.764、21.215，均P＜0.001），miR-140下调转染组的细胞凋亡率下降（t=15.064、15.228，均P＜0.001），见图5。

图4  各组细胞的细胞周期

图5  各组细胞的细胞凋亡率

2.5 各组细胞迁移及侵袭的情况对比

与C组、NC组相比，miR-140上调转染组的细胞迁移率下降（t=36.401、32.580，均P＜0.001），细胞侵袭率下降（t=21.443、20.946，均P＜0.001）；与C组与NC组相比，miR-140下调转染组的细胞迁移率上升（t=42.236、42.265，均P＜0.001），细胞侵袭率上升（t=7.636、7.426，均P＜0.001），见图6与图7。

图6  各组细胞的细胞迁移率

图7  各组细胞的细胞侵袭率

2.6 各组细胞的HDAC4蛋白相对表达量对比

与C组、NC组相比，miR-140上调转染组的HDAC4蛋白表达量降低（t=17.162、22.136，均P＜0.001），miR-140上调转染组的HDAC4蛋白表达量升高（t=6.290、6.511，均P＜0.001），见图8。

图8  各组细胞HDAC4蛋白表达量

3 讨论

近年来，miR与肿瘤发生与发展的密切关系逐渐受到了临床重视，对miR的研究可能为肿瘤诊治发现新的靶点[4]。miR-140被发现与卵巢癌、结肠癌等恶性肿瘤的发生及发展有关，下调miR-140表达可增加SKOV3卵巢癌细胞存活率，miR-140能明显促进HT29结肠癌细胞的增殖和迁移

[5-6]。说明miR-140与肿瘤细胞增殖、侵袭等活性有关。

本次研究显示，胃癌组织的miR-140表达量低于胃部正常组织，说明miR-140在胃癌组织中呈高表达状态。在细胞实验中发现，与C组、NC组相比，miR-140下调转染组在转染后的细胞生长活力升高，细胞生长抑制率降低，细胞迁移率、细胞侵袭率升高，而miR-140上调转染组产生相反的改变。说明miR-140可能在胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭活动中发挥着抑癌作用。与C组、NC组相比，miR-140下调转染组G0/G1期比率下降，S期、G2/M期比率升高，细胞凋亡率下降，而miR-140上调组产生着与之相反的改变。证实了miR-140在胃癌细胞功能中产生了抑癌的作用。HDAC4可通过p53-p73/BIK途径控制胃癌对顺铂的敏感性，是胃癌细胞中顺铂的抗性因子，HDAC4的过表达可抑制顺铂的细胞毒性[7]。而HDAC4又被发现是miR-140的靶基因[8]。本次研究发现，与C组、NC组相比，miR-140下调转染组的DAC4蛋白表达量升高，miR-140上调转染组的DAC4蛋白表达量下降。说明在胃癌细胞中，miR-140表达降低的这一变化，通过负调控使得HDAC4表达上升，进而通过HDAC4过表达所产生的药物细胞毒性抑制作用，产生对胃癌细胞的保护作用，促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移等，使得胃癌进一步发展。

综上所述，人体胃癌组织相比正常胃部组织的miR-140表达水平降低，对胃癌细胞的活力、周期、凋亡、迁移、侵袭以及HDAC4表达产生调控作用，有望成为胃癌诊治中的一个有价值的靶点。

参考文献

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