3-氨基苯硼酸联合EDTA碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE碳青霉烯酶的研究

3-氨基苯硼酸联合EDTA碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE碳青霉烯酶的研究

胡巧娟1  ,吴海清2        ,陈海云3,  ,梁亮通讯

中国人民武装警察部队广西壮族自治区总队医院消毒供应科 广西 南宁  530003

中国人民武装警察部队广西壮族自治区总队医院检验与病理科 广西 南宁530003

中国人民武装警察部队广西壮族自治区总队医院检验与病理科 广西 南宁530003

广西壮族自治区人民医院检验科  广西   南宁   530016

【摘要】目的了解3-氨基苯硼酸（APB）联合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶抑制剂增强试验（APB-EDTA 法）用于检测碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（CRE）产碳青霉烯酶的检测结果。方法  使用APB-EDTA 法测定58株CRE的碳青霉烯酶，并与金标准PCR及DNA测序检测结果的符合率比较。结果 58株CRE用APB-EDTA法均检出碳青霉烯酶，其中，产KPC酶24株（41.4%），产金属酶30株（51.7%），产D类OXA-48型酶2株（3.4%），同时产KPC和金属酶2株（3.4%），其检测结果与分子生物学检测结果的符合率为100%。结论  APB-EDTA法可以检测肠杆菌目细菌产生的A类碳青霉烯酶、B类金属酶和D类OXA-48型碳青霉烯酶，操作方法简单易行，便于临床微生物实验室开展肠杆菌目细菌产生的碳青霉烯酶的检测，为临床精准抗感染治疗以及耐药菌的感染控制提供依据。

【关键词】碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌；碳青霉烯酶；碳青霉烯酶抑制剂增强试验

【中国图书分类号】  R446.5

近年来，随着碳青霉烯类药物在临床上的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriales，CRE）的检出率呈快速上升趋势，已成为全球密切关注的耐药菌之一。因治疗药物选择有限，CRE严重威胁着患者的健康和医疗安全，给感染性疾病的治疗带来了严峻挑战[1]。CRE是指对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任一耐药者或产生碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌[2]。研究表明，产碳青霉烯酶是肠杆目细菌对碳青霉烯类药物耐药的最主要机制[3]。碳青霉烯酶包括Ambler A类、B类和D类，A类丝氨酸碳青霉烯酶最常见，以KPC为主；B类金属酶以NDM、IMP、VIM型为主；D类为OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶[4]。本文旨在用3-氨基苯硼酸（APB）联合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶抑制剂增强试验（APB-EDTA 法）检测CRE 菌株的产酶情况，并与分子生物学符合率进行比较，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源  研究的58株待试菌均为某院2020年经 PCR及DNA测序明确为产碳青霉烯酶的非重复CRE菌株。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922（阴性对照）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705（产KPC酶阳性对照）。

1.2 主要试剂和抗菌药物纸片  亚胺培南、美罗培南、厄他培南药敏纸片与MH 培养基（英国OXIOD公司），空白药敏纸片（湖南比克曼生物公司），二甲亚砜（天津科密欧公司），3-氨基苯硼酸（APB）（上海麦克林公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津致远化学试剂公司）。

1.3 A类碳青霉烯酶和B类金属酶检测  采用APB-EDTA法进行检测。参照喻华等[4] 2020年描述的APB-EDTA法操作步骤进行：将待测菌调制成0.5麦氏浊度菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板上。随后贴4张相同的碳青霉烯类抗菌药物纸片（亚胺培南/美罗培南/厄他培南）于琼脂表面，1张纸片不加任何液体，1张纸片滴加APB溶液10μL，1张纸片滴加EDTA溶液10μL，最后1张纸片同时滴加APB溶液和EDTA溶液各10μL，过夜培养后量取纸片抑菌圈直径。结果判读如下：①添加APB溶液的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5mm，即可判断待测菌产A类碳青霉烯酶；②添加EDTA溶液的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5mm，即可判断待测菌产B类碳青霉烯酶；③如仅同时添加APB和EDTA的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5mm，可判断该待测菌同时产A类和B类碳青霉烯酶；④如含酶抑制剂的碳青霉烯类纸片抑菌圈直径与单药相差均＜5mm，可判断该菌不产A类或B类碳青霉烯酶。

1.4 D类OXA-48型碳青霉烯酶检测  对不产A类或B类碳青霉烯酶的菌株同样采用APB-EDTA法检测酶型，实验步骤参照Tsakris 等[5]进行：将大肠埃希菌ATCC 25922调制成0.5麦氏浊度菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板上。将1张亚胺培南纸片贴于琼脂表面，取2张无菌空白纸片，每张纸片取经18~24小时培养的待测菌菌落3～4个，在亚胺培南左右各贴上1张已取待测菌的空白药敏纸片。然后在亚胺培南纸片左边的空白纸片加EDTA溶液10μL，在亚胺培南纸片右边的空白纸片同时加EDTA溶液和APB溶液各10μL。过夜孵育后判读结果：①含EDTA或APB空白纸片均出现细菌矢状生长者，提示该菌产OXA-48型碳青霉烯酶；②含EDTA或APB空白纸片均未出现细菌矢状生长者，提示该菌产B类碳青霉烯酶；③仅含EDTA空白纸片出现细菌矢状生长者，提示该菌产A类碳青霉烯酶。

2 结  果

2.1 菌株分布 58株CRE包括肺炎克雷伯菌33株（56.9%）、大肠埃希菌21株（36.2%）、阴沟肠杆菌2株（3.4%）、产气克雷伯菌2株（3.4%）。

2.4 碳青霉烯酶表型与分子生物学检测结果比较  58株CRE菌株经APB-EDTA法检测碳青霉烯酶100%阳性，其中，产KPC酶24株（41.4%），产金属酶30株（51.7%），产D类OXA-48型酶2株（3.4%），同时产KPC和B类金属酶2株（3.4%），其检测结果与PCR及测序检测结果的符合率为100%（表1）。

表1APB-EDTA法与PCR法检测结果比较

3 讨  论

目前关于碳青霉烯酶表型检测方法很多，CLSI、商品化的检测试剂以及文献均有相关报道和推荐。一些碳青霉烯酶表型检测的方法因操作过程中存在各种弊端，故使用并不广泛。PCR 是检测碳青霉烯酶的金标准，但目前在基层微生物实验室普及开展尚有一定困难。本研究对58株已知产碳青霉烯酶基因型的CRE菌株采用APB-EDTA法检测碳青霉烯酶并进行酶型分类，欲获取与原分子生物学方法检出结果的符合率，为基层临床微生物实验室使用提供参考。

临床微生物实验室及时进行CRE酶型检测，并在检验报告单中提示CRE耐药机制，将有助于临床CRE精准治疗，降低病死率，提高治愈率。Cointe等[6]报道，实验室如延迟对耐药菌株诸如产碳青霉烯酶型的诊断报告，将导致患者死亡率上升。本研究采用APB-EDTA 法进行碳青霉烯酶表型检测，其检测KPC型、金属酶和OXA-48型碳青霉烯酶结果与PCR方法检测结果相符率为100%。值得注意的是，本研究用APB-EDTA检测OXA-48型酶时，多次采用亚胺培南纸片检测为阳性，而用美罗培南和厄他培南纸片检测时均为阴性，其原因需进一步研究。周银娣等[7]报道，APB-EDTA法不能检出D组OXA酶，该法对产 KPC 酶菌株的符合率为99.2%，对产金属酶菌株、KPC+金属酶复合酶的符合率均为100%，其检测结果与分子生物学检测结果总体符合率为87.3%。

总体而言，APB-EDTA法简单易行，可同时检测A类、B类碳青霉烯酶和D类OXA型酶，便于基层微生物实验室使用和开展CRE碳青霉烯酶检测，为临床精准抗感染治疗提供实验室依据。

【参考文献】

[1]Li F, Ye K, Li X, et al. Genetic characterization of Carbapenem-Resistant Escherichia coli from China, 2015-2017[J]. BMC Microbiol，2021，21(1):248.

[2]Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Facility guidance for control of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE)[EB/OL]. [2020-07-01]. https://www.cdc.gov/hai/pdfs/cre/cre-guidance-508.pdf.

[3]Tilahun M, Kassa Y, Gedefie A, etal. Emerging Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Infection, Its Epidemiology and Novel Treatment Options: A Review[J]. Infect Drug Resist，2021，14:4363-4374.

[4]喻华，徐雪松，李敏，等.肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识[J].中国感染与化疗杂志，2020，20（06）：671-680.

[5]Tsakris A, Poulou A, Bogaerts P, et al. Evaluation of a new phenotypic OXA-48 disk test for differentiation of OXA-48 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae clinical isolates[J]. J Clin Microbiol,2015,53(4):1245-1251.

[6]Cointe A, Bonacorsi S, Truong J,

et al. Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae in Positive Blood Culture Using an Immunochromatographic RESIST-4 O.K.N.V. Assay[J]. Antimicrob Agents Chemother，2018，62(12):e01828-18.

[7]周银娣，郭燕，张琴，等. 3-氨基苯硼酸联合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶抑制增强试验检测肠杆菌目细菌产碳青霉烯酶的研究[J].中国感染与化疗杂志，2022，22（01）：65-71.

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