脉冲场凝胶电泳技术在食品风险监测中的应用

脉冲场凝胶电泳技术在食品风险监测中的应用

刘新宇 ,韩金玲 ,孙伟 ,金鑫 ,刘延峰

黑龙江省鹤岗市疾病预防控制中心154101

鉴于病原菌变异分析的实践和网络化分析的要求，以脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）为代表的分子生物学分型方法是细菌分子分型的“金标准”。因其具有稳定性、可重复性以及网络在线分析、数据共享等方面的优势，此技术已可成熟运用于许多种细菌的分型实验中。PFGE通过特有的电泳技术，直接或间接反映病原体变异分化的本质（即DNA序列的改变），从而做到微观变化的宏观显示。该方法的日趋成熟为监测和控制细菌的流行提供了广阔的发展空间，在传染病暴发的预警和流行菌株的监测中发挥了重要的作用。

传统的检测方法包括细菌培养、计数检测、生化反应鉴定或血清学鉴定等环节, 这些传统方法技术成熟、准确性较高、所需设备简单,目前是食品卫生检测机构的主要检测方法。然而随着检验要求的提升和检验规模的扩大, 传统方法的缺点也日益凸显，如实验操作繁琐，检测周期长，准备和收尾工作繁重、特异性不足、灵敏度低，因此需要发展简单、灵敏、准确的快速检测方法对大量样本进行筛查，大大提高了食品微生物检验的执行效率并为风险评估提供依据。

近年来, 食源性病原微生物快速检测技术获得了很大的进展。随着生物技术的进步开发了一系列基于核酸的快速检测技术。围绕这种技术配套开发了自动化检测仪器，进一步提高了食源性病原微生物的检测效率。本项目采用标准化的脉冲场凝胶电泳细菌分子分型技术，对食源性致病菌进行分子分型并进行分析比对，以识别菌株之间的分子型别，从基因层面查找致病元凶，结合流行病学调查，发现不同地区、不同食源性暴发事件及不同患者之间的暴发关联，提出预警信息，追溯传染源，为食源性疾病监测、应急处置和预防控制提供重要依据。

超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶以相同速率迁移。大于该极限长度DNA迁移速度几乎与分子大小无关。凝胶介质的分子筛效应不明显。实践表明：大于40Kb的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离。脉冲场凝胶电泳解决了这一难题，该法可以分离分子量至5Mb的DNA分子。

2020年6月至2022年12月我中心共计对540份食品样品进行检测，通过常规分离培养、初步生化鉴定及血清筛查，检出沙门氏菌17株。

根据国家食品安全风险评估中心和黑龙江省疾病预防控制中心规定的非伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌等脉冲场凝胶电泳(PFGE)实验室标准操作程序，以保证Pulse-NetChina成员进行实验室间结果的可比性。

操作步骤如下：

按照操作程序要求提前配制好细胞悬浮液（CSB）、TE缓冲液、电泳液及细胞裂解液（CLB）

（一）plug的制备：

1.挑取数个纯培养菌落加入3mlCSB无菌的EP管中充分混均，麦氏浓度4.0-4.5。

2.取400ul调节好的菌悬液加入相应的1.5ml微量离心管中，再加入20ul蛋白酶K（浓度为20mg/ml）混匀，再加入56℃400ul1%SKG琼脂糖混匀并立即注入plug模具放置室温15min。

（二）细菌的裂解：

在50 ml BD管内加入5mlCLB，放入1-4个plug，55℃温育2h，转速150r/min,保证水面高于管中裂解液的液面。

（三）plug的清洗：

将裂解液倒掉，用预热55℃无菌超纯水冲洗二遍再用TE缓冲液冲洗四遍，每次间隔15min。

（四）酶切：

1.限制性内切酶XbaI(50U/胶块)：

2.分装：每管200ul限制性内切酶混合液分装于1.5ml微量离心管中，再将切下的plug放入液面下37℃2h。

（五）酶切片段的电泳：

1、用150ml0.5*TBE配制1%SKG琼脂糖，恒温至55℃，将酶切后的胶块放置在梳齿上，缓慢倒入55℃1%SKG琼脂糖，室温凝固。

2、将2L电泳液倒入电泳槽，打开主机-泵-冷凝器，保证电泳液在管道中正常循环。

3、放入凝固好的胶，设置参数：

CHEF-mapper型脉冲场电泳仪，

Auto Algorithm模式

Low MW——30kb

High MW——700kb

按“Enter”选择默认值

Run time:18-19h

Initial switch time=2.16s;Final switch time=63.80s

按“START”键开始电泳，并记录电泳初始电流。

通过检测，共计检出17株沙门氏菌，其中共检测6大类食品，检测阳性结果分类统计如下：

（图1）                                              （图2）

建立PFGE分子分型技术，从DNA水平分析食源性致病菌的分子流行病学特征，确定不同食品来源同类菌株之间的亲缘关系，初步建立鹤岗市食源性致病菌PFGE指纹图谱库，为探索食源性致病菌分子分型、调查食源性疾病暴发流行研究提供技术基础。自2020年6月至2022年12月。通过分析近3年本地食源性致病菌沙门氏菌监测结果，掌握本地沙门氏菌主要污染肉与肉制品、现制饮料及生食水产等食品情况，通过Pulse-NetChina网络平台比对分析，对近年分离收集的食源性、不同类别样本中的遗传相关性以及在时间序列上的变化，总体来说其流行株主要以肠炎沙门氏菌为主，其他几种致病菌株均为本地常见病原菌，并未发现分子条带的显著变异株，根据检测结果，对上述食品与市场监管部门提出食源性致病暴发事件进行预警。