临床质谱检测方法应用于药物浓度检测的相关研究

临床质谱检测方法应用于药物浓度检测的相关研究

庞桂银

杭州盾恩医学检验实验室有限公司，浙江省杭州市，310000

摘要:质谱作为一种重要的分析技术，被广泛应用于物理、化学、材料学、生物学、医学等领域。质谱技术具有较高的特异性、灵敏度及可同时检测多个化合物的能力，对其的应用正成为临床实验室一个快速发展的领域。本文对MS技术作了基本介绍，包括临床实验室MS检测的相关仪器、电离技术及样品制备等，并就临床质谱检测方法应用于药物浓度检测的前景进行探讨。

关键词:临床质谱；检测方法；药物浓度

临床实验室质谱（massspectrometry,MS）技术在临床实验室中的应用随着MS分析仪的创新不断拓展。最早的MS分析仪采用扇形电场及磁场实现质量分离，体积大、价格贵。随着四极杆MS分析仪与色谱分离、第1代气相色谱（gaschromatography，GC）及液相色谱（liquidchromatography，LC）技术的联用，大大提升了MS技术的实用性。三重四极杆等多重MS技术的联用与LC分离技术令检测向高敏、可重复、定量方向发展，这是目前临床实验室开展MS检测的基础。随着MS分析仪的不断发展及轨道阱（Orbitrap）MS分析仪的诞生，LC-MS的联用更是如虎添翼。

采用GC/MS对类固醇及有机酸进行检测是MS技术最先在临床实验室应用的项目。继串联MS检测酰基肉碱诊断新生儿遗传代谢病后，其在临床检测中的应用开始加速。LC-MS联用尤其是与串联四极杆MS联用时，能实现对小分子药物及其代谢产物的量化检测，促进了该领域仪器研发的进步。治疗药物监测与毒理学的迅速发展在提升仪器灵敏度及实用性的同时，进一步扩大了MS技术的应用范围。

1、LC-MS/MS临床检验方法的开发

1.1确定目标分析物

在计划开发一个LC-MS/MS临床检测方法前，首先要了解目标分析物的特性，主要包括以下几个方面：（1）目标分析物的理化性质，如结构式、相对分子质量、沸点、极性大小及酸碱性等。（2）目标分析物的形式（游离型还是结合型，有无类似物、同分异构体或其他代谢产物）和预期浓度（是常量级还是微量级）。（3）目标分析物的临床意义，包括与疾病的相关性以及目前常用的检测方法。（4）生物样本类型，包括血清、血浆、全血、尿液、唾液、胆汁、组织等。（5）样本采集方式（静脉血、足底血、指尖血等）、处理方式（离心或静置）以及储存和运输方式（是否避光，冷藏或冷冻）。

1.2文献调研

如果对目标分析物不熟悉，则需要对目标分析物进行相关文献调研，检索并收集目标分析物的检测方法，特别是用LC-MS/MS技术检测目标分析物的文献，可以以此作为方法开发的起点。需要特别关注的关键信息包括以下几项：（1）样本前处理，包括样本类型、取样量、样本处理方式。（2）液相色谱条件，包括所选用的色谱柱类型、流动相组成、洗脱方式、流速大小、柱温和进样量。（3）质谱条件，包括选用的质谱类型、离子化方式、离子通道以及其他相关质谱参数。此外，还需要关注一些特殊的信息，如样本稳定性以及可能存在的干扰（不同收集管造成的干扰）等。

1.3质谱方法的建立与优化

临床使用的LC-MS/MS方法大部分为靶向定量方法，常采用多反应监测和选择反应监测模式进行定量分析。第1步：配制标准物质溶液直接导入质谱检测器进行质谱扫描，获取目标分析物的相关信息，根据目标分析物的极性选择合适的离子化方式[电喷雾离子源适合中等偏大极性化合物、难挥发或热不稳定性化合物，大气压化学电离离子适合有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物，根据化合物的功能基团选择正负离子模式；第2步：选择合适的离子对分别作为定量离子对和定性离子对，即选择质谱响应高、选择性和稳定性好的离子对，响应值最高的作为定量离子对。第3步：优化化合物参数，包括离子源参数和质谱扫描参数，使选择的离子对质谱响应值最高。

1.4色谱方法的建立与优化

LC-MS/MS方法开发需要考虑对色谱柱、流动相、洗脱方式等色谱条件进行选择和优化。首先，在色谱柱的选择上可以根据目标化合物的极性大小和酸碱性选择弱极性固定相，如C18、C8、C4、苯基柱等，也可以选择极性固定相，如氨基柱、氰基柱、硅胶柱等。同时要注意色谱柱的耐压范围和pH值适用范围。

在流动相的选择上，最好选择符合分析要求的溶剂，如质谱级水、色谱级或质谱级溶剂（甲醇、乙腈等）；需要用到流动相添加剂时，应选择有挥发性的甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、氨水等试剂，尽量不使用三氟乙酸、七氟丁酸等严重影响样本离子化效率的试剂；不能使用硫酸盐、磷酸盐等不挥发性碱和盐，以免造成污染，导致质谱仪损坏。在洗脱方式的选择上应按照增加色谱保留、提高分离度的目的来进行优化，选择等度洗脱或梯度洗脱，注意起始的溶剂比例、进样量、运行时间、柱温、样本溶剂等因素对分析结果的影响。此外，对检测通量要求高的实验室可以选择粒径小的色谱柱填料来实现对目标分析物的快速分离，同时需要配备较为高端的质谱仪来采集足够的数据点（10～15个点）。另外，还要注意通过液相色谱对同分异构体进行分离。

2、质谱检测方法

质谱是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比（M/Z）大小进行分离和检测的分析方法。质谱技术包括3个过程：离子化、离子的质量分析、离子的检测。在质谱仪器中，检测器是整个仪器的“眼睛”。近年来，离子化技术和质量分析技术受到广泛关注并得到飞速发展。20世纪80年代，快原子轰击离子化方法的出现，被视为质谱学进入生物学领域的里程碑，而电喷雾电离和基质辅助激光解析2种新软电离技术的出现，促使生物质谱学迅速发展起来，并成为现代科学前沿的热点之一。在质量分析器方面，四极杆质量分析器、圆柱形离子阱质量分析器、矩形离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器及傅里叶变换-离子回旋共振质量分析器都取得了很大进展。

照相法是使用最早的一种质谱检测方法。目前，该方法在质谱检测中使用较少。法拉第盘（杯）是一种最为简单的检测器，在质谱发展初期应用较多。同电子倍增器相比，法拉第收集器灵敏度比较低，限制了它的应用。由于它具有较高的信号稳定性，目前主要被用于同位素质谱中。常用的离子检测器有电子倍增器、微通道板、闪烁检测器、感应电荷检测器。

（1）电子倍增器：在20世纪30年代末就已被应用于质谱仪器中，具有灵敏度高、噪声低、响应快、对空气稳定、能直接接收离子等优点，至今仍被广泛应用。电子倍增器分为分离式和隧道式2种类型。

（2）微通道板：单个的电子倍增器基本上没有空间分辨能力，难以满足质谱学日益发展的需要。于是，人们就将电子倍增器微型化，然后集成为微通道板（MCP）检测器。由于电子倍增器的增益取决于细管长度与内径之比，而与其绝对尺寸无关，因此可将细管的内径做得很小，而不会损失增益。

（3）闪烁检测器：基质辅助激光解析电离源能够产生大分子的分子离子，使用电子倍增器作为检测器时，较大质荷比的离子到达检测器的速度较小以至不能产生足够的二次电子，使检测受限。为打破这种限制，Daly等人发展了一种新型质谱检测器--闪烁检测器也叫Daly检测器。因为它能够在低真空条件下长时间稳定工作，引起了人们的极大重视。

（4）感应电荷检测器有时也叫成像电流检测器，是一种常与傅里叶变换离子回旋共振（ICR）质量分析器联用的检测器。在ICR中，不同质荷比的离子在不同的轨道上以不同的频率运动，感应电荷检测器通过对离子运动频率的检测来分辨不同质荷比的离子。由于测量的是感应电荷（流），感应效率一般较低，导致感应电荷检测器本身的灵敏度不是很高。但是，当它与ICR等联用时，由于ICR允许离子的非破坏性测量和反复测量，使得ICR仍然具有非常高的灵敏度。由于ICR得到的是频域信号，所以需要进行反傅里叶变换才能得到质荷比的信息。最近，感应电荷检测器也已被用作离子阱质谱的检测器。

3、药物浓度检测--唾液中滥用药物分析为例

常规体内滥用药物的检测主要是选用尿液、血液或器官作为检验材料，但在现场检测滥用药物时，唾液较血液易于采集，可避免因抽血带来的身体不适、晕血及感染等，且具有不侵害他人隐私、不受时间、地点的限制、无须对收集人员进行专门训练、可防止掺假替换等优点，是滥用药物现场检测较好的生物检材。近年来对于唾液与其他体液中药物含量相关性的报道较多，用唾液代替血液在临床研究、治疗药物监测以及吸毒者滥用药物的分析等方面均有重要意义。

唾液是一种由腺体分泌的蛋白含量很低的液体。唾液与血浆药物浓度比(saliva／plasma，S／P)主要由药物经血液进入唾液的转移机制所决定。对滥用药物而言。可能的路径主要为被动扩散、主动转运和超滤作用。唾液中药物浓度的影响因素包括药物的分子量、脂溶性、药物特性、分子空间结构、电离度(pKa)、游离态药物水平、血液和唾液中的药物血浆蛋白结合率及唾液pH值和流速等。一般来说，药物分子量越小。脂溶性越高，药物跨膜转运的透过率越高，但目前认为分子量和脂溶性是次要影响因素，药物的pKa和蛋白结合率及唾液的流速、pH值是S/P的重要影响因素。高蛋白结合分子不可能进入唾液。因而药物蛋白结合率对唾液药物水平有显著影响ll3J。此外，唾液pH值、唾液流量对唾液中药物浓度也有一定影响。影响S／P的另一因素是动静脉循环和药物在口腔前庭的吸收。例如，四氢大麻酚(THC)以被动扩散方式进入血液，大部分在血中与蛋白质相结合，所以唾液中的浓度非常低。若检出唾液中THC浓度很高。则意味着此为吸食大麻烟时口腔粘膜的药物分子残留所致。

血药浓度在临床药物监测和法医学鉴定中是一个重要的参数，可为中毒判断提供直接依据。但血液的采集和样品前处理比较麻烦，而唾液样品较易采集，样品成分简单，前处理方便鉴于许多药物在血液与唾液中的浓度密切相关，可以考虑用唾液代替血液作为药物监测的样本。唾液与血液中药物含量的相关性研究，可以为滥用药物的现场检测和法医学鉴定提供理论基础。

4、结论

MS技术的应用虽尚未普及，但将成为临床实验室的发展重点。三重四级杆将广泛用于定量检测，MALDI-TOFMS将用于成像及微生物鉴定。检测目的、样品及基质情况决定了MS分析仪类型及离子化方法的选择。样品制备是临床MS检测的关键，方法开发过程中要对样品制备的速度、灵敏度及成本进行考虑及优化.目前，MS检测所面临的挑战源于多方面，挑战同时也带来机遇：采用新的色谱分离技术，发明新的分析方法，发现需要检测的新分子，发布影响临床MS技术应用的新规定等。

生物样品中滥用药物的检测受到越来越多毒物分析工作者的重视，而寻求一种快捷、简便、灵敏、准确的分析方法和简便的样品采集装置尤为重要。唾液检测具备采样方便、操作简单等特点，可以用于现场快速检测，其检测方法也逐步走向自动化、快速化，已成为滥用药物的法医学检验鉴定的一个重要方法但唾液中药物检测受到采集技术与方法、药物特性、给药途径、个体差异、年龄、机体生理疾病及情绪状态等因素的影响较大，因此应逐步建立唾液采集标准方法和检测标准。唾液中滥用药物的检测技术在今后会趋于成熟，并有重要的应用价值。

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