四种含硫培养基对丁酸梭菌计数方法比较研究

四种含硫培养基对丁酸梭菌计数方法比较研究

牛鹏飞[1]，马慧娟[2]

江苏省理化测试中心 江苏 南京210000

摘 要：在三种不同温度下用四种含硫培养基对同一丁酸梭菌样品进行菌落计数比较，结果发现亚硫酸铁琼脂计数值最高，改良亚硫酸铁琼脂培养基计数值略低，其次是TSC培养基，而在SPS培养基上计数值最低。培养基抑菌实验表明亚硫酸铁琼脂培养基较为适合杂菌污染较少的样品中丁酸梭菌计数，改良亚硫酸铁琼脂培养基较为适合含有其他污染菌样品的丁酸梭菌检测。

关键词：丁酸梭菌  培养基 计数

Abstract: The comparison of colony count of the same Clostridium butyricum samples with four sulfur-containing media at three different temperatures showed that the ferric sulfite AGAR medium had the highest value, the modified ferric sulfite AGAR medium had a slightly lower value, followed by TSC medium, and the SPS medium had the lowest value. The bacteriostatic experiment of culture medium showed that the ferric sulfite AGAR medium was more suitable for the count of clostridium butyrate in the samples with less species pollution. The improved ferric sulfite AGAR was suitable for the separation and purification of clostridium butyrate and the count of colonies, which could eliminate the pollution of mixed bacteria in the samples to a certain extent.

Key words: Clostridium butyricum   butyrate   medium count

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌、丁酸梭状芽孢杆菌或丁酸菌，属于芽孢杆菌科，梭菌属，有芽孢，孢子卵圆，是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌。研究表明丁酸梭菌具有较强的耐酸、耐胆盐和耐高温性能，对肠道致病菌肠道致病菌大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌的抑制作用，且可显著促进肠道有益菌的生长,因此是一株性能优良的饲用菌株[1]。丁酸梭菌制剂成为替代抗生素，减少抗生素的使用所引起的抗药性、二重感染等，增强机体免疫，促进消化、抵御病原菌侵袭的活的微生物[2]。我国农业部已于2009年7月批注了丁酸梭菌制剂作为微生物饲料添加剂的使用，许多饲料企业已将丁酸梭菌作为饲料添加剂广泛用于家禽、畜牧、水产等领域[3]。目前国内尚无正式发布的丁酸梭菌的检测方法标准和产品标准， 2018 年11月河南省质量技术监督局发布了地方标准《DB41/T1728-2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法》，此标准已于2020年3月作废。2019年9月，生物饲料产业技术创新战略联盟发布 T/CSWSL 006- 2019《饲料添加剂 丁酸梭菌》团体标准。2021年10月全国饲料工业标准化技术委员会组织编制的农业行业标准《饲料添加剂 丁酸梭菌（公开征求意见稿）》已经向社会公开征求意见[4]，该标准即将发布实施。通过比较相关标准和文献发现，都倾向与采用含硫培养基对丁酸梭菌进行检测。本实验选择四种含硫培养基对丁酸梭菌进行检测，通过在不同温度条件，对丁酸梭菌在四种培养基中培养计数结果的对比，进一步寻找丁酸梭菌更为科学有效的检测方法。

1.仪器与试剂

1.1 培养基          

本实验选取的四种培养基配制原料均为广东环凯生物科技有限公司生产，具体成分见下表1：

表1 四种培养基主要成分和用量

1.2 主要仪器

电热恒温培养箱：（上海龙跃LI-9272，36℃±1℃）；电热恒温培养箱：（上海森信DRP-9162 ，42℃±1℃）；电热恒温培养箱：（天津泰斯特，25℃±1℃）；旋涡振荡器（上海驰唐XW-80A）；厌氧罐（自制）；厌氧产气剂（日本三菱）；培养皿：直径为90mm；吸管：容量为1mL、10mL，三角瓶容量为500mL。

1.3 标准菌株：丁酸酸菌菌种ATCC19398（广东微生物保藏中心），金黄色葡萄球菌ATCC6538，艰难梭菌,ATCC43592，产气荚膜梭菌ATCC13124，大肠埃希氏菌ATCC25922。

2.实验过程

2.1 样品稀释：将菌种打开后，加入到已灭菌的20mL梭菌增菌培养基中，于36℃培养箱中增菌48h，取1mL加入到9mLPBS缓冲液中，于旋涡振荡器上混匀即为1：10稀释度，取1mL上述稀释液加入到9mLPBS缓冲液中，混合摇匀，得到稀释液比例为1：100，重复以上操作，得到浓度比例为10-3、10-4、10-5稀释液，每个稀释度接种8个无菌平皿，每皿加入1mL，2个平皿一组，共分为四组。

2.2 平板计数：分别用四种灭菌后冷却到46℃的培养基倾注到上述四组培养皿中，倾注完成后小心旋转平皿，将培养基与液样充分混匀，冷却凝固。将冷却凝固好的培养皿放置于厌氧罐中，放入厌氧袋，置于36℃培养箱内培养48小时，每8小时观察记录培养皿上的菌落数量。

2.3 变化温度条件，重复上述实验过程，分别在42℃，25℃温度下进行培养，观察不同温度下4种培养条件下菌落生长情况，对菌落计数结果按绘制菌落增长曲线见图1、图2、图3。

2.4 分别用灭菌后的亚硫酸铁琼脂培养基和改良亚硫酸铁琼脂培养基倾注平板，待凝固后放置过夜。用接种环分别划线接种金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、大肠埃希氏菌，36.0℃厌氧培养48小时后观察记录各标准菌株在两种培养基上的生长情况，所得结果见表2。

表2 ：培养基抑菌实验结果

3.结果与讨论

3.1菌落计数结果分析

从图1中36.0℃下四种培养基上菌落计数结果比较看，亚硫酸铁琼脂比改良亚硫酸铁琼脂对同一菌种样品计数结果略高，两者都比较接近样品菌种的实际值4.7×106CFU/mL，其次是TSC培养基，而在SPS培养基上计数结果最低。通过对42.0℃下计数结果分析，发现在该温度下四种培养基菌落计数结果比在36.0℃条件下略低；而在25.0℃下，四种培养基的菌落计数结果明显低于前两种温度。所以在一般情况下选择亚硫酸铁琼脂直接倾注法作为丁酸梭菌菌落计数培养基较好，其次是改良亚硫酸铁琼脂培养基，亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂基础(SPS)和胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)培养结果不如前两种培养基，此外在通常情况下选择36.0℃作为丁酸梭菌最佳培养温度较为合适。

3.2抑菌实验结果分析

通过对比亚硫酸铁琼脂和改良亚硫酸铁琼脂对四种标准菌株的生长实验结果，发现两种培养基都适合产气荚膜梭菌的生长，改良亚硫酸铁琼脂琼脂培养基的对金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和大肠埃希氏菌具有较好的抑制作用，而在亚硫酸铁琼脂培养基上艰难梭菌能够生长，金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌仅为生长抑制。通过对比发现改良亚硫酸铁琼脂中多粘菌素B和磺胺嘧啶钠两种药物可以在一定程度上抑制样品中杂菌的生长，较为适合含有其他污染菌样品的丁酸梭菌检测；而亚硫酸铁琼脂培养基更适合对菌种污染较少的样品中丁酸梭菌检测。

参考文献：

[1].陈秋红,孙梅,匡群等.益生菌酪酸菌CB-7的生物学特性研究[J].安徽农业科学，2011，39 (10)：5922-5925.

[2].潘晓东,酸梭菌体外粘附抗菌特性和对鮸鱼肠道生理地影响[D].杭州:浙江大学,2006.

[3].农业部关于批准丁酸梭菌和地衣芽孢杆菌为新饲料添加剂的公告(农业部公告第1231号)[EB/OL]，http://law.foodmate.net/。

[4].关于征求《饲料添加剂 丁酸梭菌》等3项农业行业标准（公开征求意见稿）意见的通知[EB/OL]：http://www.nahs.org.cn/。

第一作者简介：牛鹏飞，硕士研究生，江苏省理化测试中心工程师

第二作者简介：马慧娟，硕士研究生，江苏省理化测试中心高级工程师

注：该项目为江苏省理化测试中心自立课题