去泛素化酶USP7蛋白结构与功能的研究进展

去泛素化酶USP7蛋白结构与功能的研究进展

林凤1，庄文芳1△

上海市杨浦区市东医院检验科，上海 200000）

摘要:泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，而去泛素化酶在这种动态的蛋白质双向修饰调控系统内发挥重要作用。泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specifific protease 7,USP7)作为去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)中成员最多的USPs(ubiquitin-specific proteases)家族内的一种，可以调控多种在细胞内发挥重要作用的蛋白质的稳定性，进而在DNA的损伤与修复、表观调遗传的调控、免疫反应和病毒感染等众多病理生理过程中发挥重要作用。本文将对USP7近年来在结构及功能方面的研究进展做一综述。

关键词：去泛素化酶；泛素特异性蛋白酶7；病毒感染；肿瘤

Research Progress on Structure and Function of Deubiquitinating Enzyme-USP7

LIN Feng1，ZHUANG Wenfang1△

(1.Department of Clinical Laboratory, Shidong Hospital of Shanghai Yangpu District, Shanghai 200000, China）

Abastract:Ubiquitin proteasome system is the main pathway of protein degradation in cells, and deubiquiting enzymes play an important role in this dynamic protein bidirectional modification regulation system. Ubiquitin specific proteinase 7 (USP7), belonging to the ubiquitin specific proteases (USPS) family with the largest number of members in deubiquiting enzymes (DUBs) which can regulate the stability of various proteins that play an important role in cells. it’s also critical in many pathophysiological processes, such as DNA damage response, transcription,epigenetic regulation of gene expression, immune response and virus infection. In this paper, the research progress of USP7 in structure and function during recent years will be reviewed.

Key words:deubiquitinating enzyme;ubiquitin specific proteinase 7;viral infection;tumour

细胞作为生物体基本的结构和功能单位，在不断的合成所需蛋白质的同时，也在将错误折叠、聚集以及不再需要的蛋白质进行降解。维护适当的蛋白质稳态对细胞生长和生存至关重要。在真核细胞中，泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin–proteasome system ，UPS)控制的泛素化（ubiquitination）修饰是体内蛋白质降解的重要途径。在这个多步骤的过程中，一条多泛素链接合到蛋白质底物上，并且作为底物的信号，由26S蛋白酶体识别与降解[1]。而去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)可以特异性水解泛素C末端与靶蛋白之间形成的酯键、肽键或异肽键，使泛素与靶蛋白分离，并通过这种方式在调控细胞周期进程、蛋白质降解、基因表达、DNA修复及细胞凋亡等方面起着重要作用。泛素特异性蛋白酶作为DUBs中成员最多的蛋白酶家族，其重要成员USP7在细胞内部多种生物学过程发挥重要作用[2]。自1994年USP7被Everett R et al发现以来，这20多年对USP7的分子结构、特征性底物以及影响的生物学过程的了解不断加深，接下来本文会对USP7的研究现状做一综述。

1. USP7的结构研究

USP7是一种由7个结构域组成的大小为135 kDa的蛋白质，包括N-末端TRAF-like(Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor)结构域、催化结构域和5个C末端泛素样结构域即UBL1-5（ubiquitin-like domains）

[3] 。TRAF-like和UBL区域可以识别各种USP7底物，而催化结构域则包含了USP家族的特征性氨基酸序列如Cys、Asp (I)、His等氨基酸残基。

1.1TRAF-like结构域

USP7蛋白的N末端TRAF-like结构域（aa62-208）可以结合USP7的部分底物。抑癌基因p53是该结构域发现的第一个特征性底物，并在后续研究中不断发现新的底物。这些底物都具有共同的P/AxxS基序，并由TRAF-like结构域表面上的同一处区域所识别[4]。这种普遍的的相互作用模式表明，在与USP7结合的过程中底物之间会发生竞争。例如，肿瘤抑制基因p53和它的E3连接酶HDM2之间的竞争，是调整细胞内P53水平的一个重要方式[5]。

1.2USP7的催化结构域

DUB催化结构域的功能是结合泛素并裂解泛素与底物之间的异肽键。USP7的催化结构域是该蛋白的最大结构域（aa208-560），且位于TRAF-like结构域和UBL结构域之间。USP7以及其他半胱氨酸蛋白酶的催化机制与已经广泛研究的植物酶木瓜蛋白酶十分相似[6]。值得留意的是，最近的核磁共振研究揭示了USP7在与溶液中游离的泛素分子作用后会发生结构重排。这些结果表明，相较于游离的泛素分子，与底物的耦联才是活化USP7所必需的。更进一步研究表明，底物与其他结构域的相互作用也对酶的充分激活产生重要影响[7] 。

1.3 USP7的泛素样结构域

USP7的C羧基末端区域（aa560-1102）中的5个UBL结构域被一个39Å长的α-螺旋从催化核心区域中分隔开，而该螺旋的延伸特性对USP7活动十分重要。UBL结构域不是USP7独有，在USP家族的其他18个去泛素化酶中也包含UBLs[8] 。但是这种结构域的数目在USP9X/Y、 USP19、 USP31为1个而在USP7、 USP40和USP47中则有5个。UBLs在不同USPs中的位置也有所不同，有些结构域位于N或C末端，有些则嵌入在催化核心区域。虽然在USP蛋白中存在这样的差异，但UBL结构域表现为一个共同的调节功能。它们通过抑制或者增强酶的活性，以及将其定位到蛋白酶体来调节USPs的催化活性[9]。

越来越多的研究证据表明，不同的USP7底物被其C端区域的不同UBL域所识别。比如UBL1、2与人类XPC、RNF168、RNF169、DNMT1、UHRF1结合，UBL3含有与HDM2结合的次要位点，UBL4、5被证明可以识别p53和FOX(O)4转录因子[10]。USP7 的C端这些不同的底物特异结合位点为临床提供了潜在的治疗靶点。

2. USP7的功能
   1. USP7在DNA损伤反应中的作用

USP7对DNA损伤反应中的多种关键酶都有控制作用。比如机体最重要的抑癌基因之一p53，其细胞内水平就受到USP7的调控。而且USP7不仅可以去泛素化P53，它对p53的负调节因子HDM2也有去泛素化作用。HDM2是p53的E3泛素连接酶，参与其多泛素化以及后续降解过程[11]。在正常情况下，USP7优先与HDM2相互作用，防止其降解。然后由于HDM2可以泛素化p53，导致正常细胞内稳态时p53的细胞水平较低。DNA损伤会导致PPM1G介导的ATM依赖的USP7去磷酸化作用，降低该酶对HDM2的亲和力。这使得USP7与p53结合，通过去泛素化作用保护其免于蛋白降解[12]。

USP7可以参与核苷酸切除修复（NER）途径的调控。特别是它可以防止XPC蛋白的降解，该蛋白可以识别螺旋扭曲的DNA损伤并展开修复。USP7可以稳定RNF168和RNF169，二者控制DNA损伤反应蛋白进入染色质中双链DNA的断裂点。在BRCA缺陷细胞的DNA损伤中USP7可以去泛素化细胞周期检查点CDC25A；并且在丢失了BRCA介导的基因完整性的同时也能使细胞存活[13] 。除此之外，USP7在DNA损伤反应的ATR-CHK1相关过程中起重要作用，它可以去泛素化CHK1，调节其稳定性。

2.2DNA复制中的USP7功能

除了DNA损伤修复外，USP7可以通过稳定几个关键蛋白质在扩大DNA复制中发挥重要作用。比如USP7是微小染色体维护（MCM）复合体的一部分，并且是在S期末尾MCM复合物从染色质上有效解离的所需酶。最新研究表明USP7在复制叉上有所富集，它可以消除SUMO（Small ubiquitin-related modifier）和SUMOylated 蛋白的泛素化，这样就可以在DNA复制点创造一个SUMO富集的环境，有利于复制叉的进展[14]。

2.3USP7和病毒感染

最初，USP7是作为一种与HSV-1的早期蛋白ICP0有关的酶被学者发现。ICP0是高效裂解性感染所必需的E3泛素连接酶，与USP7的相互作用可以防止ICP0的自泛素化和蛋白酶体降解。除此之外，EB病毒的EBNA1（ Epstein-Barr virus nuclear antigen 1），干扰素调节因子1和4（viral interferon regulatory factor,vIRF1/vIRF4）,卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)的LANA（latency-associated nuclear antigen），巨细胞病毒的UL35和UL35a以及腺病毒的E1B-55K均可以和USP7发生相互作用

[15-17]。这些发现表明了USP7很可能是疱疹病毒的一个普遍靶点。USP7和不同病毒蛋白之间的相互作用可以扰乱p53基因的肿瘤抑制功能。EBNA1与MDM2相似，会与p53竞争结合USP7上的相应位点，最终增强病毒感染。病毒蛋白可以通过扰乱USP7正常细胞功能的方式，使病毒避开细胞免疫，增强感染的程度。

2.4表观遗传学中的USP7

已知USP7可以参与基因表达的表观遗传学控制，它能稳定多种可以维持染色质表观遗传学修饰的蛋白质。组织特异的DNA甲基化模式受到UHRF1和DNMT1的调控，这两种蛋白都是USP7的底物。组蛋白的单泛素化是控制基因表达的另一种普遍表观修饰方式，而USP7可以调节组蛋白的泛素化状态。它与多梳蛋白抑制复合体2和1 (PRC2, PRC1)的稳定相关，导致组蛋白H2A(K119)的单泛素化，这已成为基因抑制的一个标志物[18]。

2.5 USP7的免疫调节功能

   USP7与半胱氨酸蛋白酶之间的作用可以参与到胸腺细胞的凋亡过程。NF-κB作为炎症反应和免疫信号的重要调节因子，也受到USP7的影响。USP7能通过下调E3连接酶的活性来稳定核转录因子NF-κB，从而促进其转录活性[19]。除此之外，USP7还可以通过去泛素化FoxP3来维持Treg的细胞数量和功能[20]。

3. USP7在疾病中的作用

USP7主要在肿瘤的发展过程，以及病毒感染时病原体与宿主之间相互作用中发挥重要作用。然而，随着研究的不断深入也发现了它在多种生理病理过程中的影响，比如发育、退化、神经作用和新陈代谢紊乱等。

3.1 肿瘤

USP7在一些包括像前列腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、乳腺癌、上皮性卵巢癌、肝癌和白血病等常见的癌症中都发挥着重要作用。USP7在人类前列腺癌中高表达，并且其高水平表达与肿瘤的侵袭性直接相关。相比之下，Masuya等人发现了USP7基因表达的减少可能在非小细胞肺癌(NSCLC)中起到重要作用，特别是在腺癌中USP7可以通过p53依赖性途径来参与非小细胞肺癌的发生发展过程，稳定p53来发挥抑制肿瘤的作用[21]，此外在NSCLC中USP7还可以稳定ki -67。对结肠癌的研究发现USP7的表达上调，并可能与Wnt/PCP通路有关[22]。Su等[23]发现，USP7在宫颈癌组织中表达上调，MRN-MDC1复合物为 USP7 有效地去泛素化提供了平台并稳定 MDC1，对基因毒性损伤的抵抗力增强，促进宫颈癌细胞抵御化疗药物引起的损伤，诱发耐药。ZENG 等[24]的研究表明，骨肉瘤肿瘤组织中的USP7表达水平明显高于周围组织，并且和OS患者TNM分期和转移呈正相关。除此之外，USP7 敲除能够显著抑制 OS 细胞的转移和侵袭。而在肝癌患者中，肝癌组织中USP7的RNA

和蛋白表达水平均较正常组织有上调，并且USP7 高表达的患者临床恶性表型更加显著，包括分期较晚、肿瘤体积大、肿瘤多灶性、分化差、微血管侵犯等[25]。这些研究成果无不表明USP7在肿瘤发生发展过程中的重要性。

3.2 神经系统疾病

USP7中所包含的多聚谷氨酰胺结构提示其可能与包括像脊髓小脑共济失调、亨廷顿舞蹈病等神经退行性疾病的进程相关[26]。此外，它可以稳定神经元抑制性沉默转录因子(REST)并且维持神经干/祖细胞的状态，这也将USP7与髓母细胞瘤和神经母细胞瘤等神经细胞癌联系了起来[27]。实际上，最近的科学研究发现USP7的复制不足或过剩会破坏神经细胞的稳态，使神经性和行为上的异常发生增多，甚至会出现癫痫、肌张力减退、智力缺陷等症状。

3.3 代谢性疾病

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）的稳定受到USP7的调控，并且它在脂肪生成、葡萄糖稳态、脂质代谢以及骨生成等种种代谢过程中发挥重要作用[28]，这一机制为开发抗糖尿病药物提供新的思路。USP7介导的去泛素化可以对FOXO1进行调控进而维持肝脏的葡萄糖水平。考虑到这些分子在其余代谢组织中（如骨骼肌和脂肪组织）也发挥着重要的调节作用，这些发现证实了USP7与糖尿病以及其他代谢紊乱的关联，这使它成为研究该类疾病的一项合适靶标[29]。

3.4 心脏疾病

心脏在体内受到持续不断的代谢和机械应力，所以蛋白酶体在心脏中起着非常重要的作用，其功能障碍被认为是导致心功能不全的一个因素。蛋白酶体的损伤对多种心血管疾病如心肌病、心力衰竭、心肌缺血等均会产生影响，愈发凸显了负责蛋白质降解的泛素-蛋白酶系统的重要性。在心脏应激状态下，MDM2可以单泛素化FOXO4来增加其转录活性，而这一过程可以被USP7介导的去泛素化作用拮抗。FOXO靶点atrogin-1的泛素化以及对磷酸酶的下调，能够阻止Akt介导的心肌肥厚的信号转导，并且atrogin-1也可作为FOXO共激活剂通过非典型多泛素化抑制Akt介导的信号转导[30-31]。

4.前景和展望

    USP7在DNA损伤反应、基因表达的表观调控、免疫反应和病毒感染等众多病理生理过程中发挥重要作用。随着近年来对USP7研究工作的重大进展，对其分子结构和蛋白质功能有了更深的了解。如今已经研究出USP7的多种小分子抑制剂，并应用于多种肿瘤疾病的治疗，有望为肿瘤治疗带来新的发展方向。而鉴于USP7功能的多样性，尚有很多地方值得研究者们去发掘，将基础研究的成果转化到临床应用当中。

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