三种肺结核实验室诊断方法评估[1]

三种肺结核实验室诊断方法评估[1]

赵,静2  ,田敏敏1, ,邓淑文1, 李金方3  ,赵蓉芬1*

1苏州高新区人民医院检验科         江苏苏州 215129  2苏州市第五人民医院临床检验中心    江苏苏州215131  3苏州高新区疾病预防控制中心疾控科 江苏苏州215011

【摘要】：目的 阐明LAMP技术联合痰涂片和培养检测在肺结核确诊诊断的价值，为制定和完善本区肺结核的防控指南提供依据.方法 收集送检疑似肺结核患者痰标本563份，进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。结果 检测563份结核门诊送检痰标本中，257份来自临床诊断肺结核病例痰标本，三种检测方法阳性率由高到低依次为：分子检测LAMP阳性率最高（53.7%），培养阳性率次之（47.5%），直接涂片阳性率最低（15.2%）；35例临床诊断肺结核患者三种方法检测同时阳性，占13.6%， 培养和LAMP检测同时阳性率64例，最高（24.9%）；306份临床诊断非肺结核病例痰标本，272例三种检测方法检测未检到结核分枝杆菌，实验室检查阴性率占88.9%，假阳性率由高到低分别为LAMP检测5%，培养4.2%，涂片1%。结论 LAMP（环介导恒温扩增）技术可以作为培养方法的替代技术，帮助临床医生早期诊断，确诊肺结核，并进行抗结核治疗。

【关键词】 肺结核；涂片；固体培养；lamp

2020 年苏州高新区发病率为 49.13/10 万，肺结核仍居苏州市法定报告甲、乙类传染病首位，防控形势仍旧严峻。 急需快速、准确、简便的诊断技术和预防结核病感染新疫苗、新药品的出现［1］。

常规的TB 实验室检测技术主要是痰涂片和痰培养，因涂片染色镜检法敏感度较低，培养法耗时较长，无法对结核病患者进行早期诊断。近年，环介导等温扩增技术通过设计结核分枝杆菌特异引物，等温扩增，具有特异性高、时间短、操作简单等优点[2]，已经应用于全国各级结核病实验室，我院于2017年引进此项技术用于结核病的诊断，而目前在本地区尚缺乏应用LAMP诊断肺结核病的评价报道。

   本研究采用痰涂片镜检法、固体培养法、LAMP同时对563例我院结核门诊送检的同一份痰标本进行检测，以中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断》(WS 288-2017)为标准，依据肺结核临床诊断为参考，评价LAMP在肺结核确诊诊断中的价值。

一、材料和方法

结核分枝杆菌实验室检测方法

1痰标本收集：

收集2017 年 6 月至 2020 年 5月 在苏州高新区人民医院结核门诊送检疑似肺结核患者痰标本563份，其中，257份为临床诊断肺结核病例和306份临床诊断非肺结核病例痰标本，所有痰标本均进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。

2检测方法

2.1直接涂片法: 按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的标准化操作程序执行。染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

2.2固体培养法: 按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》 中的标准化操作程序执行。罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司 。

2.3环介导恒温扩增检测（Lamp）：按照《广州迪奥结核菌环介导恒温扩增检测试剂盒说明书》操作。仪器为迪奥恒温扩增检测仪Deaou-16P，试剂购自广州迪奥生物科技有限公司。

二、结 果

1． 257例临床诊断肺结核患者痰标本实验室检测结核分枝杆菌结果:

由表1可见，根据行标《肺结核诊断》5.3肺结核确诊标准，257例临床诊断肺结核病例，只有159例为确诊肺结核患者，占临床诊断病例的61.9%，三种检测方法阳性率由高到低依次为：分子检测LAMP阳性率最高（53.7%），培养阳性率次之（47.5%），直接涂片阳性率最低（15.2%）；35例临床诊断肺结核患者三种方法检测同时阳性，占13.6%， 培养和LAMP检测同时阳性率64例，最高（24.9%）。

        表1.257例临床诊断肺结核患者痰标本实验室检测结核分枝杆菌结果

2.306例临床诊断非肺结核患者痰标本实验室检测结核分枝杆菌结果:   

   由表2可见，306例临床诊断非肺结核病例，272例三种检测方法检测未检到结核分枝杆菌，实验室检查阴性率占88.9%，假阳性率由高到低分别为LAMP检测5%，培养4.2%，涂片1%。

        表2.306例临床诊断非肺结核患者痰标本实验室检测结核分枝杆菌结果

   三，讨 论

     本研究发现直接涂片法的阳性率为15.2% ，LAMP 检测结核分枝杆菌（MTB）的阳性率为 53.3%，明显高于涂片镜检（15.2%），略高于固体培养（47.5%），我们的研究结果高于贾枫[3]等(43.57%)和陈伊14]等人（45.0%）的研究报道。提示LAMP方法检测结核分枝杆菌的临床应用价值高于痰涂片镜检法和固体培养法。

另外，涂片，培养和LAMP三种方法检测结果同时阳性者只占13.6%，而培养和LAMP同时阳性者占24.9%，LAMP方法检测敏感性与培养检测敏感性具有很高的一致。对临床诊断MTB患者，LAMP 检测可以作为快速确诊MTB的方法。在不具备培养条件的实验室，LAMP方法可以代替培养方法帮助临床医生确诊肺结核诊断[6]。值得注意的是，临床诊断病例中由38.1%的患者痰标本，无论LAMP方法，和传统的涂片，培养方法均检测未检出TB,说明即便实验室病原学检测阴性，临床医生依据肺结核的临床诊断可进行抗结核治疗。

   306例临床诊断非肺结核患者痰标本，272例为三种方法检测均阴性，阴性率为88.9%， LAMP方法假阳性率最高（5.9%），培养假阳性率为4.2%，而涂片假阳性率最低，只有1.0%。

本研究中，LAMP与固体培养结果不完全一致。可能原因:（1）LAMP阳性而固体培养阴性，LAMP阳性与MTB活力无关，而固体培养阳性的前提是标本中必须有活的 MTB存在且活力较好，未受到药物打击受损等，或者与罗氏固体培养阳性所需 MTB数目较多有关，罗氏固体培养阳性标本中需要的 MTB 菌数需 1×102 /ml[5]，而 LAMP只需要标本中存在微量的结核分枝杆菌DNA就能检测到。（2）固体培养阳性而LAMP阴性，原因可能与操作程序不到位，LAMP检测时未取到含有 MTB的痰标本，或取样量不足导致被取标本中所含 MTB 数量低于检测限[6]。

综上所述， LAMP方法可以代替培养方法帮助临床医生确诊肺结核诊断，进行早期诊断和治疗。

参考文献：

[1]World Health Organization.Global tuberculosis report 2021 ［R］. Geneva：World Health Organization，2021.

[2]杨健,张天华,鲜小萍,等.5种病原学检测方法在肺结核病诊断中的应用评价[J].中国人兽共患病学报,2019,35(07):672-676.

[3]贾枫,叶海容,曾云龙,等.环介导等温扩增技术（LAMP）在肺结核诊断中的应用研究[J].实验与检验医学,2021,39(05):1041-1043.

[4]陈伊,黄文焰,邓君丽.LAMP技术检测结核分枝杆菌的临床时效性分析[J].国际检验医学杂志,2018,39(13):1622-1624+1628. 

[5]刘宁,付洪义,孙金昊,等.四种病原学方法在检测痰液标本中结核杆菌的诊断价值对比[J].公共卫生与预防医学,2021,32(06):107-110.

[6]杨健,张天华,鲜小萍,等.环介导等温扩增技术在肺结核病诊断中的应用评价[J].中国实验诊断学,2018,22(12):2095-2098.

[1] 基金项目：苏州高新区人民医院科学创新基金（SGY2018B12）

※通讯作者：赵蓉芬E-mail:zhaorongfenn@163.com