白芨对根管粪肠球菌的体外抑菌实验

白芨对根管粪肠球菌的体外抑菌实验

雷张辰，陈梦莹，朱玉杰，季晨烨，汪淑华

浙江中医药大学

【摘要】目的：通过白芨提取液联合次氯酸钠(NaClO)或EDTA冲洗液在体外对粪肠球菌作用，判断加入白芨是否能够更加高效地抑制杀灭粪肠球菌，进行根管消毒治疗，以单纯根管冲洗剂次氯酸钠和EDTA作为对照以评价其作用效果。方法：采用湿法提取新鲜白芨，经热回流浸提、旋转蒸发获取白芨冲洗液。以琼脂培养法及药敏试验验证粪肠球菌对白芨的敏感性。利用滤纸片扩散程度辅助判断作用效果，确定白芨提取液联合其他冲洗液对粪肠球菌的抑菌效果。采用 SPSS23.0 统计软件对试验数据先进行正态分布检验和方差齐性检验后，样本间的数据采用单因素方差分析，采用SNK-q进行数据的差异显著性分析，得出结论。结果：20%白芨提液联合EDTA或NaClO抑菌环直径最大，抑菌效果较单一使用EDTA或NaClO好。最小抑菌浓度为100 mg /ml。结论：白芨提取液对粪肠球菌有抑菌作用，且与EDTA或NaClO联用时，白芨提取液浓度越大，抑菌效果越强。

【关键词】白芨；粪肠球菌；抑菌试验

牙髓根尖周病是常见的口腔疾病，主要有微生物感染、创伤或刺激等诱发因素，细菌感染是其最主要的病因。主要临床表现为牙齿疼痛、出血肿痛等[1]，对人们的生活质量造成严重影响。因此，患者在发病之后需要及时进行有效的治疗。根管治疗是该病目前公认的首选治疗方法，但该手术繁琐，治疗后可能会导致持续性根周感染。粪肠球菌是顽固性或继发性根管内感染的主要致病菌，在营养物质缺乏、高碱性的恶劣环境中能长期生存，并形成再感染，在根管治疗失败的过程中扮演着十分重要的角色[2]。至今未有一种理想根管药物用来对抗粪肠球菌感染。白芨为兰科植物白芨的泥土下的块茎，又名白及，具收敛止血、消肿生肌等功效，有保护黏膜、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡等药理作用[3-4]。其可能能够更加高效地抑制杀灭粪肠球菌，进行根管消毒治疗。本实验通过研究白芨提取液联合其他冲洗液对粪肠球菌的抑菌效果，为白芨在控制粪肠球菌感染中的应用提供理论和实践基础。

一、村料和方法

1.菌悬液制备：将粪肠球菌菌种在适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下37℃于培养箱中培养活化(细菌24h)，备用。利用麦氏比浊法，用无菌生理盐水稀释制成含菌量为108个/mL的菌悬液。

2. 40%白芨提取液制备:(1)制备静置液:将新鲜白芨干燥后并用粉碎机将其粉碎,并对其使用滤网进行过滤加入40%的乙醇搅拌后静置,制得静置液;(2)制备提取液:对静置液进行离心分离,取其上清液,并对其回流提取,制得提取液；(3)制备白芨提取液:对提取液减压浓缩至无醇味,并加入去离子水,逐步升温后溶解稀释,调节PH到3.5-4,干燥后得白芨提取液。

3.不同浓度白芨提取液的制备：(1)取3 ml 40%白芨提取液于试管，加入3 ml蒸馏水，获得20%白芨提取液;(2)取3 ml 20%白芨提取液于试管，加入3 ml蒸馏水，获得10%白芨提取液;(3)取3 ml 20%白芨提取液于试管,加入3 ml 10%白芨提取液,获得15%白芨提取液。

4.滤纸片制备：把配制好的各种适宜浓度的冲洗液，每3张已消毒滤纸片加入0.5ml 药液，使其均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。

5.研究不同浓度的白芨提取液在TSA培养皿上的渗透抑菌能力:实验分为10%白芨提取液+3 ml 1%次氯酸钠组、15%白芨提取液+3 ml 1%次氯酸钠组、20%白芨提取液+3 ml 1%次氯酸钠组、10%白芨提取液+3 ml 17%EDTA组、15%白芨提取液+3 ml 17%EDTA组、20%白芨提取液+3 ml 17%EDTA组，3 ml 1%次氯酸钠+3 ml蒸馏水组，3 ml 17% EDTA+3ml蒸馏水组，用蒸馏水以倍比稀释法将白芨提取液配成浓度为:10%、15%、20%。3 ml 1%次氯酸钠+3ml蒸馏水组，3 ml 17% EDTA+3 ml蒸馏水组为对照。采用滤纸片抑菌法判断白芨提取液MIC抑菌能力,即用吸管吸取0.3 mL被试菌液，加到培养皿上，用接菌棒涂布均匀。将滤纸片用无菌镊子夹取，放在含菌平板上，每皿5片，每种处理做2次重复。细菌置于37℃培养24 h，测定滤纸片的抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。

二、结果

1.EDTA与白芨提取液在TSA平皿上的渗透抑菌能力。

表1   24小时后粪肠球菌抑菌圈直径(mm)

表2 均值与标准差

表3 组间方差分析

在37℃培养箱培养24小时后，经测量可得EDTA组抑菌圈直径均值为15.97 mm；10%白芨+EDTA组抑菌圈直径均值为23.57 mm；15%白芨+EDTA组抑菌圈直径均值为24.97 mm；20%白芨+EDTA组抑菌圈直径均值为27.40 mm。

白芨提取液对粪肠球菌有抑菌作用，且与EDTA联用时，白芨提取液浓度越大，抑菌效果越强。

经方差分析，各组间差异具有统计学意义（P<0.05）。

讨论 粪肠球菌是难治性根尖周炎中最常见的细菌之一，以往研究证明粪肠球菌可渗入牙本质小管内深达1 000 μm处，而常规机械预备仅能清除75 μm左右的感染牙本质壁，即使用最先进的激光辅助技术配合化学冲洗剂进行根管荡洗也仅能清除大约500 μm处的细菌[5]。在长期的临床操作治疗中发现，牙周的机械治疗具有一定的局限性:例如牙周病变治疗过程中牙周袋内存在一些器械不易达到的感染部位，在这种情况下就需要药物辅助配合以达到杀灭或彻底控制局部牙周感染的目的，从而阻止牙周病变的发展并预防复发[6]。临床常用的药物中，抗菌类药物以抗生素类药物为主，但是目前尚缺乏一种既安全，又能有效杀灭粪肠球菌的理想药物。有研究表明白芨对粪肠球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等有较强的抗菌活性[7]。作为天然药物白芨有不易产生细菌耐药性和对人体毒副作用低的特点,说明其有可能成为安全有效的根管消毒药物的研究方向。

本实验采用滤纸片抑菌法测定粪肠球菌对白芨提取液的敏感性，发现白芨提取液对粪肠球菌有抑菌作用，且与EDTA联用时，白芨提取液浓度越大，抑菌效果越强。但其他浓度的白芨提取液其有效成份有待于进一步研究。

参考文献

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[2]宁 杨，凌均蓕．饥饿状态的粪肠球菌的研究进展[J]．国际口腔医学杂志，2012（4）：461-463.

[3]王红莹，李春燕，宋发军 . 一株白及内生细菌的分离鉴定及抑菌机理初步研究[J]. 中南民族大学学报（自然 科学版），2021，40（3）：246-251.

[4]左世梅. 药用植物白及化学成分和药理作用研究进展[J]. 中国现代医生，2021，59（4）：189-192.

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[6]苏媛媛. 百里香酚对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用与光动力疗法对不同预备程度根管内粪肠球菌的杀菌作用研究[D].郑州大学,2021.DOI:10.27466/d.cnki.gzzdu.2021.004891.

[7]Qian CD, Jiang FS, Yu HS, et al.Antibacterial Biphenanthrenes from the Fibrous Roots of Bletilla striata[J].J Nat Prod, 2015, 78 (4) :939-943.DOI:10.1021/np501012n.